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CryoStor Criopreservação Protocolo

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

Soluções CryoStor criopreservação são usados ​​para preparar e preservar as células em ultra baixa temperatura ambiente, sem a necessidade de soro, proteínas, ou altos níveis de agentes citotóxicos.

Abstract

Criopreservação eficácia - o que inclui a recuperação pós-descongelamento, viabilidade e funcionalidade é importante para ambas as pesquisas e aplicações clínicas. As tensões acumuladas que resultam do processo de criopreservação e congelamento suboptimal resultado media na morte de células da necrose e apoptose. 1-5 células e tecidos podem ser preparados e conservados em ultra ambientes de baixa temperatura (-80 ° C a -196 ° C), utilizando CryoStor criopreservação soluções. Uma vez que estas soluções são formulados para abordar os aspectos da biologia molecular de células durante o processo de criopreservação, reduzem o nível de criopreservação morte celular induzida por início tardio, melhorando assim a pós-descongelamento viabilidade celular e função. Além disso, eles precisam incluir soro, proteínas, ou altos níveis de agentes citotóxicos é eliminado com este protocolo. Neste artigo de vídeo, vamos demonstrar os procedimentos para o congelamento, armazenamento e descongelamento de células, bem como uma avaliação da viabilidade das células pós-descongelamento.

Protocol

1. Células preparando para Criopreservação

  1. Para se preparar para a criopreservação de células, colocar em suspensão por dissociação mecânica ou enzimática.
  2. Em seguida, centrifugar células para obter um pellet de células.
  3. Após a centrifugação, remover o máximo de meios de cultura sobrenadante possível, para reduzir a diluição da solução CryoStor, que será adicionado na próxima etapa.
  4. Antes de abrir a garrafa de solução CryoStor frio, limpe a parte externa do recipiente com álcool 70%.
  5. ISOLAMENTO: Adicionar CryoStor fria para obter concentrações de células de 0,5-10 x 10 6 células / mL.
  6. PRÉ-FREEZE: Incubar a suspensão de células a 2-8 ° C por aproximadamente 10 minutos.

2. Congelamento e armazenamento de células

  1. Para congelar sistemas de células de mamíferos mais, use uma taxa padrão de protocolo de resfriamento lento e controlado com um dispositivo de congelamento ou recipiente isopropanol pré-resfriado a 2-8 ° C.
  2. Nucleação: Congelar as amostras a -80 ° C.
  3. Após aproximadamente 10 min. a -80 ° C, iniciar a nucleação de gelo dentro da amostra (semeadura) em cerca de -5 ° C usando um programa de ruptura de nitrogênio líquido configuração em um freezer taxa controlada ou agitação mecânica (filme ou toque) do recipiente cryovial / amostra.
  4. Congelar as células por 3-4 horas (para container isopropanol).
  5. CONSERVAÇÃO: Para armazenamento de longo prazo, as amostras lugar a temperaturas de nitrogênio líquido, abaixo de -130 ° C. Armazenamento da amostra a -80 ° C é recomendado apenas para armazenamento a curto prazo de semanas a meses.

3. Células descongelamento

  1. As amostras congeladas devem ser descongeladas rapidamente em banho-maria a 37 ° C. Agite suavemente a amostra (s) até que todo o gelo derreteu visíveis. O tempo aproximado para descongelar uma amostra de 1 mL em uma cryovial é de aproximadamente 3 minutos.
  2. Não permita que a amostra (s) para aquecer acima das temperaturas refrigeradas (0-10 ° C). Quando removido do banho de água, o cryovial (s) deve ser fria ao toque.
  3. Diluir a mistura de células / CryoStor imediatamente com meios de cultura que está entre 20 ° C e 37 ° C, utilizando uma razão de diluição de 1:10 ou maior de amostra para a mídia.
  4. Células placa na configuração apropriada.
  5. Células colocar em condições de cultura ou utilizar imediatamente.
  6. Vinte e quatro horas pós-descongelamento, avaliar as células para a viabilidade.

4. Resultados representativos

  1. Resultados da avaliação de viabilidade celular de 24 horas pós-descongelamento são vistos na Figura 1. Comparar os resultados das células descongeladas com não-congelados controles.

Figura 1
Figura 1. Recuperação de fibroblastos humanos, após a criopreservação em meios de cultura tradicionais / soro / DMSO ou o soro-livre e livre de proteína intracelular CryoStor-like: normal fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) foram criopreservados em meios de cultura / soro / DMSO ou em meios de CryoStor criopreservação. Após o descongelamento, as células foram autorizados a se recuperar em condições de cultura padrão (37 ° C / 5% de ar CO 2 / úmido) em media de crescimento de fibroblastos. As células foram analisadas em 24 horas pós-descongelamento com alamarBlue para avaliar adequadamente a viabilidade celular após a manifestação do início retardado processos de morte celular, como apoptose e necrose secundária.

Discussion

Este vídeo demonstraram a eficácia de uma solução de criopreservação criopreservação intracelular-like sem soro e proteína livre em comparação com um cryococktail tradicional feita a partir de meio de cultura, soro e DMSO. Como criopreservar as células, os benefícios de usar uma solução de criopreservação intracelular-like, e um exemplo de como avaliar a viabilidade das células verdadeira pós-descongelamento foram delineadas. É importante notar que, porque as células morrem por apoptose e necrose pós-descongelamento durante um período de horas a dias, o que é observado como Percebida Viabilidade imediatamente pós-descongelamento pode não ser a verdadeira viabilidade a longo prazo. Esta morte celular de início retardado pode, posteriormente, o impacto da qualidade do enxerto de células ea recuperação eficaz de celulares capacidades funcionais, os quais são fundamentais para o sucesso do celular clínicos e terapias de tecidos.

Disclosures

Aby Mathew é empregado por Biolife Solutions, Inc, que produz o reagente utilizado neste artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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