Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor Криоконсервация протокола

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

CryoStor криоконсервации решения используются для подготовки и сохранения клеток в сверхнизкой температуры среды, без необходимости использования сыворотки, белков, или высокие уровни цитотоксических агентов.

Abstract

Криоконсервация эффективность - который включает в себя после оттепели восстановления жизнеспособности и функциональности имеет важное значение для обоих исследований и клинического применения. Совокупный подчеркивает, что в результате процесса криоконсервации и субоптимальные заморозить средства массовой информации приводят к гибели клеток от некроза и апоптоза. 1-5 Клетки и ткани могут быть подготовлены и сохранены в сверхнизких температур среды (-80 ° С до -196 ° C) с помощью CryoStor криоконсервации решений. Так как эти решения разработаны для адреса молекулярно-биологические аспекты клеток при криоконсервации процесса, они снижают уровень криоконсервации вызванные задержкой началом гибели клеток, повышая таким образом после оттепели жизнеспособность клеток и функции. Кроме того, они должны включать сыворотки, белков, или высокие уровни цитотоксических препаратов устраняется с этим протоколом. В этом видео статьи мы продемонстрируем процедуры для замораживания, хранения и оттаивания клеток, а также оценка жизнеспособности клетки после оттепели.

Protocol

1. Подготовка Клетки для криоконсервации

  1. Для подготовки к криоконсервации, место клеток в суспензии механическим или ферментативной диссоциации.
  2. Далее, центрифуги клетки получить осадок клеток.
  3. После центрифугирования, удалите как можно больше питательных сред супернатант насколько возможно, уменьшить разбавления раствора CryoStor, которая будет добавлена ​​в следующем шаге.
  4. Перед тем как открыть бутылку холодного раствора CryoStor, протереть снаружи контейнера с 70% этанола.
  5. ИЗОЛЯЦИЯ: Добавить холодной CryoStor получить ячейку концентрациях 0,5-10 х 10 6 клеток / мл.
  6. PRE-FREEZE: Инкубируйте клеточной суспензии при температуре 2-8 ° С в течение примерно 10 минут.

2. Замораживание и хранение клетки

  1. Чтобы заморозить большинство млекопитающих клетки, использование стандартных медленно контролируемого охлаждения протокол с замораживанием устройство или изопропанол контейнер предварительно охлаждается до 2-8 ° C.
  2. НУКЛЕАЦИИ: замораживание образцов при -80 ° C.
  3. Примерно через 10 мин. при -80 ° C, инициировать льда зарождения внутри образца (посев) примерно -5 ° C с использованием либо жидкость программы взрыв азота установки на контролируемых морозильник ставки или механического перемешивания (фильм или водопроводной) из криопробирку / контейнер для пробы.
  4. Замораживание клетки в течение 3-4 часов (для изопропанола контейнера).
  5. ХРАНЕНИЕ: для длительного хранения, место образцов при температуре жидкого азота, ниже -130 ° С. Пример хранения при температуре -80 ° С рекомендуется только для кратковременного хранения от нескольких недель до месяцев.

3. Размораживание Клетки

  1. Замороженные образцы должны быть талой быстро в 37 ° С водяной бане. Аккуратно водоворот образца (-ов), пока все видимые лед не растает. Приблизительное время оттепели на 1 мл образца в криопробирку составляет примерно 3 минуты.
  2. НЕ допускайте образца (ов), чтобы нагреть выше температуры охлажденной (0-10 ° С). Когда удаляется из водяной бане, криопробирку (ов) должна быть прохладной на ощупь.
  3. Развести клеток / CryoStor смеси непосредственно с культурой СМИ, что находится между 20 ° C и 37 ° C, с помощью разбавления соотношении 1:10 или больше образцов для средств массовой информации.
  4. Пластина клеток в соответствующей конфигурации.
  5. Место клеток в условиях культивирования или использовать немедленно.
  6. Двадцать четыре часа после оттепели, оценить клетки для жизнеспособности.

4. Представитель результаты

  1. Результаты оценки жизнеспособности клеток 24-часов после оттепели видны на рисунке 1. Сравните результаты талой клеток с немерзлых управления.

Рисунок 1
Рисунок 1. Восстановление человеческих фибробластов следующие криоконсервации в традиционных СМИ, культура / сыворотка / ДМСО или без сыворотки и белка, свободного внутриклеточного подобные CryoStor: нормальный фибробластов кожи человека (NHDF) были криоконсервированных в культуре средств массовой информации / сыворотка / ДМСО или в CryoStor криоконсервации СМИ. После оттаивания, клетки было позволено восстановить при стандартных условиях культуры (37 ° C / 5% CO 2 / влажного воздуха) в средствах массовой информации роста фибробластов. Клетки анализировали через 24 часов после оттепели с alamarBlue надлежащим оценки жизнеспособности клеток после проявления позднему наступлению смерти клетки процессов, таких как апоптоз и вторичного некроза.

Discussion

Это видео показали криоконсервации эффективности внутриклеточного типа, свободной от сыворотки и белка без криоконсервации решение по сравнению с традиционными cryococktail из культуральной среды, сыворотки, и ДМСО. Как cryopreserve клеток, преимущества использования внутриклеточных подобные криоконсервации решение, и пример того, как оценить Правда Жизнеспособность клеток после оттепели наметились. Важно отметить, что из клетки погибают путем апоптоза и некроза после оттепели в течение периода от нескольких часов до нескольких дней, что и наблюдается в восприятии Жизнеспособность сразу же после оттепели, возможно, не правда жизнеспособности в долгосрочной перспективе. Это задержало начало гибели клеток может в дальнейшем повлиять на качество клеточной приживления и эффективного восстановления клеточных функциональных возможностей, оба из которых являются критическими для успеха клинической клеточной и тканевой терапии.

Disclosures

Абы Мэтью работает на BIOLIFE Solutions, Inc, которая производит реагента, который используется в этой статье.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor Криоконсервация протокола
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter