Summary
Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.
Abstract
Yetişkin fare retina kök hücre (RSC), memeli göz 1,2,3 siliyer epitel (CE) içinde bulunan nadir bir sükunet hücre . Tüm form CE pigmentli olmayan, iç ve pigmentli dış hücre tabakaları oluşur, ve CE tek bir pigmente hücreden ortaya çıkan klonal RSC koloniler ayırt edilebilir hem pigmente ve non-pigmentli hücreler oluşur nöral retina ve RPE hücre türleri. Küreler içindeki tüm hücreleri en azından bazı pigment 4 içerip içermediğine ilişkin bazı tartışmalar vardır, ancak hücreleri hala 1-3 nöral retina içinde bulunan farklı hücre tiplerini oluşturma yeteneğine sahiptirler. Amfibiler ve balık gibi bazı türler, ikisinin de gözleri, ancak, 5 yaralanma sonrası rejenerasyon yeteneğine sahip memeli gözü böyle bir rejeneratif özelliklerini gösterir. Hatta yaralanma sonrası yanı sıra, göz hasarı tamir fiziksel veya genetik modeller yardım için potansiyel bir hücre kaynağı olarak kullanarak, in vivo kök hücre tespit etmek ve 6-8 memeli retina kök hücreler sükunet devam mekanizmaları anlamak isteyen 9-12 yoluyla nakli. Burada klonal retina kök hücre küre oluşturmak için fare göz siliyer epitel hücreleri izole ve kültür alanında büyümek nasıl açıklar. In vivo kök hücre hiçbir bilinen marker olduğu için, bu alanlarda ileriye dönük göz siliyer epitel içinde kök hücre popülasyonunu belirlemek için tek bilinen yolu.
Protocol
1. Diseksiyon Çözümleri ve Enzim Çözümleri hazırlayın
- Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF) ve vaktinden önce Serum Medya olun ve buzdolabına kaldırın.
- Kynurenic Asit (0.2 mg / ml) tartılır ve kolayca çözülür olmadığından vaktinden 37 ° C su banyosunda 10 ml hilo ACSF içinde çözülür.
- Tripsin (1.33 mg / ml) ve Hyaluronidase (0.67 mg / ml) ve 15 ml tüp içinde yer tartılır ve gerektiği kadar -20 ° C'de tutmak. Bu tüp Kynurenic asit çözeltisi ekleyin ve kullanımdan hemen önce 22 mikron şırınga filtre kullanarak filtre.
- Tripsin inhibitörü tartılır (Ovamucoid: 1 mg / ml) ve ılık serum serbest Medya ve 22μm şırınga filtre kullanarak filtre içinde çözülür.
- FGF2 (10 ng / ml) ve heparin (2 mcg / ml) içeren serum serbest Medya: kaplama medya olun.
2. Fare Göz Retina Kök Hücreler Yalıtımlı
- Retina kök hücre izolasyonu, primer kültür deneyler adanmış bir özel steril oda yapılır. Bu yordama başlamadan önce, diseksiyon mikroskobu ve soğuk ışık kaynağı kurmak ve daha sonra steril diseksiyon aletleri yatıyordu. Her kaput adımlar arasındaki aletleri sterilize etmek için sıcak bir boncuk sterilizatör vardır.
- Biz, kendi çıkarılmasından sonra onaylanmış hayvan etik protokolleri göre kurban fareler Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF) içeren bir steril Petri kabı hemen konuldu gözleri retina kök hücreleri izole olacak.
- Diseksiyon mikroskobu altında, forseps ile göz temiz saç ve kornea / skleral sınır bağlı bağ dokusu kurtulmak. Daha sonra ACSF yeni bir çanak göz aktarın.
- Nazikçe göz dişli forseps ile sabit tutarken, göz kasları kaldırmak için açılı mikro diseksiyon makas kullanın. Yine de göz bağlıysa aynı zamanda optik sinir çıkarın. Bu işlem sırasında göz ezmek için değil deneyin. ACSF yeni bir çanak gözleri aktarın.
- Sonraki kullanım kavisli mikro diseksiyon makas göz yarısında kesmek için: optik sinir başlar ve korneanın orta kesti, arka kesim başlatılan optik sinir toplantı. Bu bir sonraki adıma daha kolay yapacaktır, çünkü iki adet göz boyutu kabaca eşdeğer idealdir.
- , Iki göz kabuğu hafifçe, iki forseps kullanarak kornealar Holding dışında yarıya indirir. Çıkarın ve objektif, iç organları, göz kabukları nöral retina atın. ACSF yeni bir yemek kabukları aktarın.
- Şimdi siliyer epitel izole etmek için hazırız. Başlamak için, yönlendirmek göz kabuk, sağ ve Retina Pigmente epiteli (RPE) kornea olduğunu solda. Göz kabuğu RPE tarafında düz forseps ile yavaşça aşağı pin.
- Sonra, yavaşça neşter aşağı iterek yerine kesme hareketleri kullanarak, gözün silier epitel uzak kornea ve iris kesmek için bir neşter kullanabilirsiniz.
- Bundan sonra, RPE uzak siliyer epitel kesti. Non-dişli forseps ACSF içeren yeni bir 35 mm çanak siliyer epitelin şerit aktarmak için kullanın.
- Aynı şekilde, diğer göz kabuk siliyer epitel izole eder.
- Hem siliyer epitel şeritler toplanan edildikten sonra, 2 mL Dispase içeren 35 mm çanak içine şeritler aktarın. 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör şeritler ile çanak yerleştirin.
- 10 dakika sonra 2 mL süzülmüş tripsin, Hyaluronidase ve Kynurenic Asit içeren bir çanak içine Dispase şeritler aktarın. 37 çanak yerleştirin ° C 10 dakika.
- Şimdi diseksiyon mikroskobu dönmek. Sklerasına düz forseps ile basılı tutarak, yavaşça sklerasına uzak siliyer epitel kazımak için kavisli olmayan dişli forseps alt kullanın.
- Çanak sklerasına çıkarın. Şimdi çanak bırakılması gerektiğini, ilgi ve enzim çözüm hücrelerdir.
- Bir yangın cilalı pamuk takılı pipet kullanarak bu çözüm, 14 ml'lik bir tüp içine aktarın. Bu çözüm 30 kez Karışım pipet içinde ve dışında çözüm hafifçe zorlayarak epitel hücreleri parçalayın.
- 1500 RPM az 5 dakika boyunca tüp santrifüjleyin. Hücrelerin bu aşamada tüp alt kapalı geliyor eğilimli olduğundan santrifüj yapıldığında, dikkatli bir şekilde santrifüj tüp kaldırmak.
- Yangın cilalı bir pipet kullanarak süpernatantı çoğunluğu yavaşça aspire ve sonra tripsin inhibitörü 1 ml serum serbest Medya hücrelere ekleyin. Bir tek hücre süspansiyonu kadar yaklaşık 50 kez numune çiğnemek için küçük bir kuyu içi pamuk takılı pipet kullanın.
- 1500 RPM az 5 dakika için tekrar tüp santrifüjleyin.
- Süpernatantı ve kaplama orta 1 ml ile değiştirin. Hücrelerin tekrar süspansiyon yangın parlatılmış cam pipet kullanarak hafifçe Karışım.
- Sayımından sonrahücreleri, plaka, 24 plaka istenilen yoğunlukta ing. Biz genellikle plaka 10 hücre / orta her iyi ilk dolum ve ardından hücre süspansiyonu eklenerek son hacim 500 mcL medya almak için mcL.
- 7 gün sonra ortaya çıkan küre sayısı kadar hareket ettirilebilir, 37 ° C CO 2 inkübatör plaka koyun.
3. Retina Kök Hücreler görme Sonuçları
- Bu işlemi başarıyla yapıldığında, düşük yoğunluklu (Şekil 1) ayrışmış ve kaplama edildikten sonra disseke siliyer epitel hücreleri böyle bakmak gerekir.
- Kültür 7 gün sonra, ortaya çıkan retina kök hücre küre sayılır. Bir kürenin çapı ve kök hücre elde edilen küre olarak sayılmak üzere serbest yüzen 75 mikron üzerinde olmalıdır. (Şekil 2). Ancak, bazı hücreler sınırlı çoğalması ve form parçacıklarının büyüklüğü kriter uymayan ve kök hücre elde edilen küre olarak sayılmayacaktır; böyle bir sfero bir örneği burada gösterilir (Şekil 2).
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1.
Şekil 2.
Discussion
Bu protokol fare göz 1-3 siliyer epitel retina kök hücreleri izole anlatılmaktadır. Siliyer epitelin şeritler izole metodoloji ancak tek bir hücre süspansiyonu ulaşmak için enzimler ve metodoloji bu protokolü optimize edilmiştir değişebilir. Bu toplam sayısı her göz izole edilebilir küre üzerinde olumsuz bir etkisi var görünüyor bu yana izole edilmiştir siliyer epitel şeritler RPE veya korneanın büyük miktarda olmadığını da önemlidir. Buna ek olarak, biz, aslında beyin neurospheres 13 için formüle edildi yaptığınız serum ücretsiz medya retina kök hücre küre yetiştirmek için idealdir. Bir de onlar büyüyen küreler birlikte 14 toplu kalmamanız kaplama ve inkübatöre yerleştirilir sonra hücreler rahatsız olmadığını emin olmalısınız.
Retina kök hücreler klonal küreler oluşturmuşlardır sonra, bu kök hücreler göz için ileriye dönük bir numara almak için sayılabilir. Küreler sonra tek hücre içine ayrılamaz ve tespit kendini yenileme yetenekleri geçişli veya büyüme faktörleri farklı kombinasyonları ve / veya protein kullanarak nöral retina ve RPE farklı hücre tipleri ayrılabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Laura Clarke, Biz onu paha biçilmez bir yardım için teşekkür ederim. Kök Hücre Ağı, CIHR ve NIH: Bu çalışma NCE tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
- Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
- Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
- Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
- Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
- Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).
- Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
- Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).
- Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
- Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).
- Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).
- Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).
- Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).
- Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. , 208-201 (1999).
- Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
