Summary
Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.
Abstract
O adulto do rato com células-tronco da retina (RSC) é uma célula quiescente rara encontrada no epitélio ciliar (CE) do olho de mamífero 1,2,3. A CE é composta por não-pigmentada interior e camadas de células pigmentadas exterior, e as colônias clonais RSC que surgem a partir de uma única célula pigmentada da CE são feitas de ambas as células pigmentadas e não pigmentadas que podem ser diferenciadas para formar todos os tipos de células da retina neural e RPE. Existe alguma controvérsia sobre se todas as células dentro das esferas contêm pelo menos cerca de 4 pigmento, porém as células ainda são capazes de formar os diferentes tipos de células encontradas na retina neural 1-3. Em algumas espécies, como anfíbios e peixes, seus olhos são capazes de regeneração após a lesão 5, no entanto, o olho dos mamíferos não mostra tais propriedades regenerativas. Procuramos identificar as células-tronco in vivo e para compreender os mecanismos que mantêm a retina de mamíferos as células-tronco quiescentes 08/06, mesmo após a lesão, bem como usá-los como uma fonte potencial de células para ajudar a reparar os modelos físico ou genético de lesão ocular através do transplante 9-12. Aqui nós descrevemos como isolar as células ciliares do epitélio do olho do rato e cultivá-las em cultura, a fim de formar a esferas clonal das células da retina-tronco. Como não existem marcadores conhecidos da célula-tronco in vivo, estas esferas são a única maneira conhecida para prospectivamente identificar a população de células-tronco dentro do epitélio ciliar do olho.
Protocol
1. Preparar as soluções Dissecting e soluções enzimáticas
- Faça o fluido cerebral Artificial Spinal (ACSF) eo soro de mídia livre antes do tempo e leve à geladeira.
- Pesar o ácido cinurênico (0,2 mg / mL) e dissolver em 10 mL de hilo ACSF em um banho-maria 37 ° C antes do tempo, uma vez que não se dissolve prontamente.
- Pesar a tripsina (1,33 mg / mL) e hialuronidase (0,67 mg / mL) e coloque em um tubo de 15 mL e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário. Adicionar a solução de ácido cinurênico a este tubo e filtrar através de um filtro de seringa de 22 M apenas antes de usar.
- Pesar inibidor de tripsina (Ovamucoid: 1 mg / mL) e dissolver em água morna soro livre de Mídia e filtro com filtro de seringa de 22μm.
- Fazer a media chapeamento: Soro sem mídia contendo FGF2 (10 ng / mL) e heparina (2 mg / mL).
2. Isolar células estaminais da retina do olho do rato
- Isolamento das células-tronco da retina é realizado em uma sala específica estéril dedicada a experimentos de cultura primária. Antes de iniciar este procedimento, configure o microscópio de dissecação e de luz fria de origem e, em seguida, estabelecer os instrumentos estéreis de dissecação. Cada capa tem um esterilizador quente talão para a esterilização dos instrumentos entre as etapas.
- Vamos isolar células-tronco na retina dos olhos que foram colocados imediatamente em uma placa de Petri estéreis, contendo Fluid Cerebral Artificial Spinal (ACSF) após a sua retirada de camundongos sacrificados de acordo com a ética protocolos animais aprovados.
- Sob o microscópio de dissecação, limpar o olho com uma pinça: livrar-se do cabelo e do tecido conjuntivo que é anexado à córnea / border escleral. Em seguida, transferir o olho a um novo prato com ACSF.
- Enquanto delicadamente segurando o olho parado com uma pinça serrilhada, use ângulo micro-dissecando tesouras para remover os músculos oculares. Remover o nervo óptico, bem como se ele ainda está ligado ao olho. Tente não esmagar o olho durante este processo. Transferência de olhos para um novo prato com ACSF.
- Use próxima curva micro-dissecando tesoura para cortar o olho ao meio: começar no nervo óptico e passou no meio da córnea, reunião de volta ao nervo óptico onde o corte foi iniciado. O ideal é que as duas partes do olho são aproximadamente equivalentes em tamanho, porque isso vai dar o próximo passo mais fácil.
- Segurando as córneas utilizando duas pinças, descascar delicadamente o olho duas metades separadas. Remova e descarte a lente, vísceras, ea retina neural das conchas dos olhos. Transferir as cascas para um novo prato com ACSF.
- Agora estamos prontos para isolar o epitélio ciliar. Para começar, orientar shell o olho para que a córnea está à sua direita eo epitélio pigmentado da retina (EPR) é à esquerda. Suavemente o pino shell olho para baixo com uma pinça reta do lado RPE.
- Em seguida, use um bisturi para cortar a córnea ea íris longe do epitélio ciliar do olho empurrando levemente para baixo sobre o bisturi ao invés de usar movimentos de corte.
- Depois disso, corte o epitélio ciliar longe do RPE. Uso não-serrilhada fórceps para transferir a faixa de epitélio ciliar de um prato de 35 mm contendo novas ACSF.
- Da mesma forma, isolar o epitélio ciliar da shell outro olho.
- Uma vez que ambas as tiras ciliar epiteliais foram recolhidos, transferir as tiras em um prato de 35 mm contendo 2 ml de Dispase. Coloque o prato com as tiras em uma incubadora de 37 ° C por 10 minutos.
- Após 10 minutos, transferir as faixas a partir do Dispase em um prato contendo 2 ml de tripsina filtrado, hialuronidase e ácido cinurênico. Coloque o prato a 37 ° C por 10 minutos.
- Agora retorne ao microscópio de dissecação. Enquanto mantém a esclera para baixo com uma pinça reta, use a parte inferior da curva não-serrilhada pinça para delicadamente raspar o epitélio ciliar longe da esclera.
- Remova a esclera do prato. Tudo o que deve ser deixado no prato agora são as células de interesse e da solução enzimática.
- Usando um fogo-polido algodão ligado de pipeta, transferir essa solução para um tubo de 14 ml. Triturar esta solução 30 vezes para quebrar as células epiteliais delicadamente forçando a solução dentro e fora da pipeta.
- Centrifugar o tubo por 5 minutos a 1500 RPM. Quando a centrifugação estiver pronto, retire o tubo da centrífuga cuidadosamente vez que as células são propensas a saindo do fundo do tubo nesta fase.
- Aspirar cuidadosamente a maioria do sobrenadante com uma pipeta-fogo polido, e em seguida, adicione 1 mL de inibidor de tripsina em soro livre de mídia para as células. Use um pequeno furo de algodão ligado de pipeta para triturar a amostra de cerca de 50 vezes até que é uma suspensão de uma única célula.
- Centrifugar o tubo novamente por 5 minutos a 1500 RPM.
- Remover o sobrenadante e substituí-la por 1 mL de seu meio de placas. Triturar delicadamente usando uma pipeta de vidro polido-fogo para ressuspender as células.
- Depois que a contagemção das células da placa, eles na densidade desejada em uma placa de 24 cavidades. Nós placa geralmente 10 células / microlitro, preenchendo cada cavidade primeiro com o meio e depois da adição da suspensão celular para obter um volume final de 500 mL de mídia.
- Coloque a placa em um 37 ° C incubadora de CO 2, onde não será movido até você contar as esferas que surgem após 7 dias.
3. Resultados de isolamento de células-tronco da retina
- Quando este procedimento é realizado com sucesso, o dissecados ciliar células epiteliais deve ficar assim depois de ter sido dissociadas e banhado em baixa densidade (Figura 1).
- Após 7 dias em cultura, as esferas de células-tronco da retina que surgem são contados. A esfera deve ser superior a 75 m de diâmetro e livre-flutuante para ser contada como uma célula-tronco derivadas esfera. (Figura 2). No entanto, algumas células terão esferóides limitada proliferação e de formulário que não atender critério de tamanho e não será contado como esferas de células-tronco derivadas; um exemplo de um esferóide como é mostrado aqui (Figura 2).
4. Resultados representante
Figura 1.
Figura 2.
Discussion
Este protocolo descreve como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do mouse ocular 1-3. A metodologia para isolar as tiras de epitélio ciliar pode variar, no entanto as enzimas e metodologia para alcançar uma suspensão de uma única célula foram otimizados neste protocolo. Também é importante que as tiras do epitélio ciliar que foram isolados não contêm grandes quantidades de RPE ou córnea uma vez que estes parecem ter um impacto negativo sobre o número total de esferas que podem ser isoladas de cada olho. Além disso, os meios de comunicação sem soro que fazemos que foi originalmente formulado para o cérebro neurospheres 13, é ideal para o cultivo de células da retina esferas tronco. Deve-se também certificar-se que as células não sejam perturbados depois de terem sido banhado e colocado na incubadora para que as esferas de crescimento não se agregam em conjunto 14.
Uma vez que as células-tronco da retina formaram esferas clonal, que pode ser contado para obter um número potencial de células-tronco por olho. As esferas, em seguida, pode ser dissociada em células individuais e várias passagens para verificar auto-renovação ou capacidades diferenciadas em diferentes tipos de células da retina neural e RPE usando diferentes combinações de fatores de crescimento e / ou proteínas.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Laura Clarke pelo seu inestimável apoio. Este trabalho é suportado pelo NCE: Rede de Células-Tronco, CIHR e NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
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