בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

Summary

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

Abstract

עכבר בוגר לתא גזע הרשתית (RSC) הוא תא שקט נדיר נמצא בתוך אפיתל ריסי (CE) של העין יונקים ^1,2,3. CE מורכבת של אי - פיגמנטציה בשכבות הפנימיות פיגמנט התא החיצונית, המושבות RSC המשובטים הנובעות תא פיגמנט אחד מן לספירה בנויים שני תאים פיגמנט ולא פיגמנט שיכול להיות מובחן כדי ליצור כל תא סוגים של הרשתית העצבית ואת הרשתית. אין מחלוקת לגבי השאלה אם כל התאים בתוך הספירות כולם מכילים לפחות חלק פיגמנט ^4, אולם התאים עדיין מסוגלים להרכיב את סוגי תאים שונים נמצא בתוך הרשתית העצבית ^1-3. בכמה מינים, כגון דו חיים ודגים, עיניהם מסוגלים התחדשות לאחר פציעה ^5, לעומת זאת, את העין יונקים מראה שום תכונות ההתחדשות כאלה. אנו שואפים לזהות את תא גזע in vivo ו להבין את המנגנונים לשמור על בתאי יונקים גזע רשתית שקט ^6-8, גם לאחר פציעה, כמו גם להשתמש בהם כמקור פוטנציאלי של תאים כדי לעזור לתקן מודלים פיזיים או הגנטי של פגיעה בעין באמצעות השתלת ^9-12. כאן אנו מתארים כיצד לבודד את התאים אפיתל ריסי מן העין העכבר לגדל אותם בתרבית על מנת ליצור את המשובטים רשתית תא גזע התחומים. מכיוון שאין סמנים ידועים של התא גזע in vivo, בתחומים אלה הם הדרך היחידה הידועה פרוספקטיבית לזהות את האוכלוסייה בתאי גזע בתוך אפיתל ריסי העין.

Protocol

1. הכן את פתרונות הביתור, פתרונות אנזימים

1. הפוך את נוזל השדרה מלאכותית מוחין (ACSF) ואת סרום ללא מדיה מראש ושומרים במקרר.
2. תשקלי את חומצה Kynurenic (0.2 מ"ג / מ"ל) ו להמיס 10 מ"ל של חילו ACSF ב 37 ° C waterbath מראש מאחר ואינה מוכנה לפרק.
3. תשקלי את טריפסין (1.33 מ"ג / מ"ל) ו Hyaluronidase (0.67 מ"ג / מ"ל) ומכניסים צינורית 15 מ"ל one ולשמור אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. מוסיפים את פתרון חומצה Kynurenic אל הצינור הזה מסנן באמצעות מזרק מסנן 22 מיקרומטר רק לפני השימוש.
4. לשקול את מעכבי טריפסין (Ovamucoid: 1 מ"ג / מ"ל) ו להתמוסס סרום ללא מדיה חם מסנן באמצעות מסנן מזרק 22μm.
5. הפוך את התקשורת ציפוי: סרום ללא מדיה המכילה FGF2 (10 ng / mL) ו הפרין (2 מיקרוגרם / מ"ל).

2. בידוד בתאי גזע רשתית העין של העכבר

1. בידוד של הרשתית מתאי גזע מתבצע בחדר סטרילי ספציפי המוקדש לתרבות ניסויים ראשוניים. לפני הפעלת פרוצדורה זו, להגדיר את המיקרוסקופ לנתח קר מקור אור, ולאחר מכן לפרוס את הכלים לנתח סטרילית. מכסה מנוע לכל אחד יש מעקר חרוז חם לעיקור המכשירים בין השלבים.
2. אנו לבודד בתאי גזע רשתית מהעיניים כי הונחו מיד בצלחת פטרי סטרילית המכילה מלאכותית נוזל השדרה מוחין (ACSF) לאחר ההסרה שלהם מעכברים הקריב על פי פרוטוקולים האתיקה אישרה בעלי חיים.
3. תחת מיקרוסקופ הניתוחים, לנקות את העין עם מלקחיים: להיפטר משיער לבין רקמת החיבור המצורף הקרנית / גבול scleral. ואז להעביר את העין צלחת חדשה עם ACSF.
4. בעוד מחזיק את העין בעדינות נייח עם מלקחיים משונן, שימוש בזווית מיקרו לנתח מספריים כדי להסיר את שרירי העין. הסר את עצב הראייה גם אם היא עדיין מחוברת העין. נסו לא squish העין במהלך תהליך זה. העברת עיניים בצלחת חדשה עם ACSF.
5. השימוש הבא מעוקל מיקרו לנתח עם מספריים בכדי לחתוך את העין במחצית: להתחיל עצב הראייה ואת לחתוך באמצע הקרנית, פגישה בחזרה עצב הראייה שבו לחתוך יזם. הוא אידיאלי אם שני החלקים של העין שוות בערך בגודל כי זה יעשה את הצעד הבא קל יותר.
6. החזקת קרניות באמצעות שני מלקחיים, לקלף בעדינות עין שני חצאים בנפרד. הסר וזורקים את העדשה, הקרביים, ואת רשתית עצבית מן הפגזים העין. מעבירים את הקליפות על צלחת חדשה עם ACSF.
7. עכשיו אנחנו מוכנים כדי לבודד את אפיתל ריסי. כדי להתחיל, לכוון את הקליפה העין כך הקרנית נמצא בצד ימין שלך ואת אפיתל פיגמנט הרשתית (הרשתית) הוא בצד שמאל. סיכה בעדינות את הקליפה עין למטה עם מלקחיים ישר בצד הרשתית.
8. בשלב הבא, להשתמש אזמל לחתוך את הקרנית ואת איריס הרחק אפיתל ריסי העין על ידי בעדינות דוחף את האזמל במקום להשתמש בתנועות ניסור.
9. אחרי זה, לחתוך את אפיתל ריסי מן הרשתית. השימוש הלא משונן מלקחיים להעביר את רצועת אפיתל ריסי על צלחת בגודל 35 מ"מ חדש המכיל ACSF.
10. באותו אופן, לבודד את אפיתל ריסי פגז את העין השנייה.
11. לאחר שתי רצועות אפיתל ריסי נאספו, להעביר את רצועות לתוך צלחת בגודל 35 מ"מ המכיל 2 מ"ל של Dispase. מניחים את המנה עם רצועות של 37 ° C בחממה במשך 10 דקות.
12. לאחר 10 דקות, להעביר את רצועות מתוך Dispase לתוך צלחת ובה 2 מ"ל של טריפסין מסונן, Hyaluronidase, וחומצה Kynurenic. מניחים את המנה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
13. עכשיו לחזור המיקרוסקופ לנתח. בעוד מחזיק את בלובן העין למטה עם מלקחיים ישר, השתמש התחתון של הלא משונן מלקחיים המעוגל בעדינות לגרד את אפיתל ריסי ממנו בלובן העין.
14. הסר את בלובן העין מן המנה. כל זה יש להשאיר בצלחת עכשיו הם תאים עניין הפתרון האנזים.
15. באמצעות אש מלוטש כותנה פקוק פיפטה, להעביר את הפתרון הזה לתוך צינור 14 מ"ל. Triturate פתרון זה 30 פעמים להתפרק לתאי האפיתל על ידי בעדינות לכפות פתרון בתוך ומחוץ פיפטה.
16. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 1500 סל"ד. כאשר צנטריפוגה נעשה, להסיר את הצינור מתוך צנטריפוגה בזהירות מאז התאים נוטים יורד התחתון של הצינור בשלב זה.
17. לשאוב בעדינות מרבית supernatant בעזרת פיפטה אש מלוטש, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של מעכבי טריפסין ב סרום ללא מדיה לתאים. השתמש כותנה פקוק קטן הקידוח פיפטה כדי triturate המדגם כ 50 פעמים עד שהוא השעיה תא בודד.
18. צנטריפוגה הצינור שוב במשך 5 דקות ב 1500 סל"ד.
19. הסר את supernatant ולהחליפה 1 מ"ל של מדיום ציפוי שלך. Triturate בעדינות בעזרת פיפטה אש מלוטש זכוכית resuspend התאים.
20. לאחר ספירתing התאים, צלחת אותם בצפיפות הרצויה בצלחת 24 באר. בדרך כלל אנחנו צלחת 10 תאים / μL ידי מילוי כל הבאר הראשונה עם בינוני ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה התא כדי לקבל נפח סופי של 500 μL של התקשורת.
21. מניחים את צלחת 37 ° C-CO ₂ באינקובטור בו לא יועברו עד לספור את תחומי המתעוררות לאחר 7 ימים.

3. תוצאות של בידוד בתאי גזע רשתית

1. כאשר הליך זה מבוצע בהצלחה, התאים גזור אפיתל ריסי אמור להיראות כך לאחר הפרידו מצופה בצפיפות נמוכה (איור 1).
2. לאחר 7 ימים בתרבית, תאים ברשתית גזע תחומי שעולות נספרים. כדור צריך להיות מעל 75 מיקרומטר בקוטר חופשי צף להיות נחשב לתא גזע בתחום הנגזרים. (איור 2). עם זאת, תאים מסוימים תהיה מוגבלת התפשטות טופס spheroids שאינן עומדות בקריטריון הגודל לא ייספרו כתא גזע שמקורם התחומים; דוגמה spheroid כזה מוצג כאן (איור 2).

4. נציג תוצאות

באיור 1.

איור 2.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן האפיתל של ריסי העיניים העכבר ^1-3. המתודולוגיה בשביל לבודד את רצועות של אפיתל ריסי יכול להשתנות, אולם אנזימים מתודולוגיה להשגת השעיה תא בודד מוטבו בפרוטוקול זה. חשוב גם כי רצועות של אפיתל ריסי שהיו מבודדים אינם מכילים כמויות גדולות של הרשתית או קרנית שכן אלה נראה שיש השפעה שלילית על המספר הכולל של הכדורים כי יכול להיות מבודד כל עין. בנוסף, סרום ללא התקשורת כי אנו עושים זאת גובשה במקור עבור המוח neurospheres ^13, הוא אידיאלי לגידול תאים ברשתית תחומי גזע. כדאי גם לוודא כי התאים לא מוטרדים אחרי שהם כבר מצופה והניח בחממה כך הספירות גדל אינם מצטברים יחד ^14.

ברגע שתאי הגזע רשתית יצרו תחומי המשובטים, הם יכולים לסמוך כדי לקבל מספר פוטנציאלי של בתאי גזע לכל עין. הכדורים ואז לאחר מכן ניתן ניתק לתוך תאים בודדים passaged עצמית חידוש יכולות לקבוע או מובחן לתוך תאים מסוגים שונים של הרשתית הרשתית העצבית באמצעות שילובים שונים של גורמי גדילה ו / או חלבונים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.
מקור אור קר	Carl Zeiss, Inc.	KL1500	אור אופטי זרוע כפולה
מספריים מיני ואנות מעוקל	כלי מדע עדינים	15000-10
מספריים וואנות זוויתיות	כלי מדע עדינים	15005-08
#7 מלקחיים של דומונט	כלי מדע עדינים	11272-30	לא משוננים
#5 מלקחיים של דומונט	כלי מדע עדינים	11251-10	מלקחיים עדינים ישרים
	Science Tools	11051-10	מעוקל משונן
#3 ידית אזמל	Almedic	2586-M36-10
#10 להבי אזמל	Almedic	2580-M90-10
מעקר חרוזים	חמים Fine Science Tools	18000-45
Dispase	VWR international	CACB354235
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1005
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H6254
Kynurenic Acid	Sigma-Aldrich	K3375	1000 IU
מעכב טריפסין	Roche Group	10109878001
35 מ"מ צלחות	VWR בינלאומי	CA354235
24 בארות צלחת	VWR international	CA73521-004
פיפטות כותנה תקומות	VWR בינלאומי	14672-400	פוליש
אש 14 מ"ל צינורות	Falcon BD	352057	פוליסטירן
ללא			מדיה Ref# 13 לניסוח
FGF2	Sigma-Aldrich	F0291
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	100 IU