Summary
בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.
Abstract
עכבר בוגר לתא גזע הרשתית (RSC) הוא תא שקט נדיר נמצא בתוך אפיתל ריסי (CE) של העין יונקים 1,2,3. CE מורכבת של אי - פיגמנטציה בשכבות הפנימיות פיגמנט התא החיצונית, המושבות RSC המשובטים הנובעות תא פיגמנט אחד מן לספירה בנויים שני תאים פיגמנט ולא פיגמנט שיכול להיות מובחן כדי ליצור כל תא סוגים של הרשתית העצבית ואת הרשתית. אין מחלוקת לגבי השאלה אם כל התאים בתוך הספירות כולם מכילים לפחות חלק פיגמנט 4, אולם התאים עדיין מסוגלים להרכיב את סוגי תאים שונים נמצא בתוך הרשתית העצבית 1-3. בכמה מינים, כגון דו חיים ודגים, עיניהם מסוגלים התחדשות לאחר פציעה 5, לעומת זאת, את העין יונקים מראה שום תכונות ההתחדשות כאלה. אנו שואפים לזהות את תא גזע in vivo ו להבין את המנגנונים לשמור על בתאי יונקים גזע רשתית שקט 6-8, גם לאחר פציעה, כמו גם להשתמש בהם כמקור פוטנציאלי של תאים כדי לעזור לתקן מודלים פיזיים או הגנטי של פגיעה בעין באמצעות השתלת 9-12. כאן אנו מתארים כיצד לבודד את התאים אפיתל ריסי מן העין העכבר לגדל אותם בתרבית על מנת ליצור את המשובטים רשתית תא גזע התחומים. מכיוון שאין סמנים ידועים של התא גזע in vivo, בתחומים אלה הם הדרך היחידה הידועה פרוספקטיבית לזהות את האוכלוסייה בתאי גזע בתוך אפיתל ריסי העין.
Protocol
1. הכן את פתרונות הביתור, פתרונות אנזימים
- הפוך את נוזל השדרה מלאכותית מוחין (ACSF) ואת סרום ללא מדיה מראש ושומרים במקרר.
- תשקלי את חומצה Kynurenic (0.2 מ"ג / מ"ל) ו להמיס 10 מ"ל של חילו ACSF ב 37 ° C waterbath מראש מאחר ואינה מוכנה לפרק.
- תשקלי את טריפסין (1.33 מ"ג / מ"ל) ו Hyaluronidase (0.67 מ"ג / מ"ל) ומכניסים צינורית 15 מ"ל one ולשמור אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. מוסיפים את פתרון חומצה Kynurenic אל הצינור הזה מסנן באמצעות מזרק מסנן 22 מיקרומטר רק לפני השימוש.
- לשקול את מעכבי טריפסין (Ovamucoid: 1 מ"ג / מ"ל) ו להתמוסס סרום ללא מדיה חם מסנן באמצעות מסנן מזרק 22μm.
- הפוך את התקשורת ציפוי: סרום ללא מדיה המכילה FGF2 (10 ng / mL) ו הפרין (2 מיקרוגרם / מ"ל).
2. בידוד בתאי גזע רשתית העין של העכבר
- בידוד של הרשתית מתאי גזע מתבצע בחדר סטרילי ספציפי המוקדש לתרבות ניסויים ראשוניים. לפני הפעלת פרוצדורה זו, להגדיר את המיקרוסקופ לנתח קר מקור אור, ולאחר מכן לפרוס את הכלים לנתח סטרילית. מכסה מנוע לכל אחד יש מעקר חרוז חם לעיקור המכשירים בין השלבים.
- אנו לבודד בתאי גזע רשתית מהעיניים כי הונחו מיד בצלחת פטרי סטרילית המכילה מלאכותית נוזל השדרה מוחין (ACSF) לאחר ההסרה שלהם מעכברים הקריב על פי פרוטוקולים האתיקה אישרה בעלי חיים.
- תחת מיקרוסקופ הניתוחים, לנקות את העין עם מלקחיים: להיפטר משיער לבין רקמת החיבור המצורף הקרנית / גבול scleral. ואז להעביר את העין צלחת חדשה עם ACSF.
- בעוד מחזיק את העין בעדינות נייח עם מלקחיים משונן, שימוש בזווית מיקרו לנתח מספריים כדי להסיר את שרירי העין. הסר את עצב הראייה גם אם היא עדיין מחוברת העין. נסו לא squish העין במהלך תהליך זה. העברת עיניים בצלחת חדשה עם ACSF.
- השימוש הבא מעוקל מיקרו לנתח עם מספריים בכדי לחתוך את העין במחצית: להתחיל עצב הראייה ואת לחתוך באמצע הקרנית, פגישה בחזרה עצב הראייה שבו לחתוך יזם. הוא אידיאלי אם שני החלקים של העין שוות בערך בגודל כי זה יעשה את הצעד הבא קל יותר.
- החזקת קרניות באמצעות שני מלקחיים, לקלף בעדינות עין שני חצאים בנפרד. הסר וזורקים את העדשה, הקרביים, ואת רשתית עצבית מן הפגזים העין. מעבירים את הקליפות על צלחת חדשה עם ACSF.
- עכשיו אנחנו מוכנים כדי לבודד את אפיתל ריסי. כדי להתחיל, לכוון את הקליפה העין כך הקרנית נמצא בצד ימין שלך ואת אפיתל פיגמנט הרשתית (הרשתית) הוא בצד שמאל. סיכה בעדינות את הקליפה עין למטה עם מלקחיים ישר בצד הרשתית.
- בשלב הבא, להשתמש אזמל לחתוך את הקרנית ואת איריס הרחק אפיתל ריסי העין על ידי בעדינות דוחף את האזמל במקום להשתמש בתנועות ניסור.
- אחרי זה, לחתוך את אפיתל ריסי מן הרשתית. השימוש הלא משונן מלקחיים להעביר את רצועת אפיתל ריסי על צלחת בגודל 35 מ"מ חדש המכיל ACSF.
- באותו אופן, לבודד את אפיתל ריסי פגז את העין השנייה.
- לאחר שתי רצועות אפיתל ריסי נאספו, להעביר את רצועות לתוך צלחת בגודל 35 מ"מ המכיל 2 מ"ל של Dispase. מניחים את המנה עם רצועות של 37 ° C בחממה במשך 10 דקות.
- לאחר 10 דקות, להעביר את רצועות מתוך Dispase לתוך צלחת ובה 2 מ"ל של טריפסין מסונן, Hyaluronidase, וחומצה Kynurenic. מניחים את המנה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- עכשיו לחזור המיקרוסקופ לנתח. בעוד מחזיק את בלובן העין למטה עם מלקחיים ישר, השתמש התחתון של הלא משונן מלקחיים המעוגל בעדינות לגרד את אפיתל ריסי ממנו בלובן העין.
- הסר את בלובן העין מן המנה. כל זה יש להשאיר בצלחת עכשיו הם תאים עניין הפתרון האנזים.
- באמצעות אש מלוטש כותנה פקוק פיפטה, להעביר את הפתרון הזה לתוך צינור 14 מ"ל. Triturate פתרון זה 30 פעמים להתפרק לתאי האפיתל על ידי בעדינות לכפות פתרון בתוך ומחוץ פיפטה.
- צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 1500 סל"ד. כאשר צנטריפוגה נעשה, להסיר את הצינור מתוך צנטריפוגה בזהירות מאז התאים נוטים יורד התחתון של הצינור בשלב זה.
- לשאוב בעדינות מרבית supernatant בעזרת פיפטה אש מלוטש, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של מעכבי טריפסין ב סרום ללא מדיה לתאים. השתמש כותנה פקוק קטן הקידוח פיפטה כדי triturate המדגם כ 50 פעמים עד שהוא השעיה תא בודד.
- צנטריפוגה הצינור שוב במשך 5 דקות ב 1500 סל"ד.
- הסר את supernatant ולהחליפה 1 מ"ל של מדיום ציפוי שלך. Triturate בעדינות בעזרת פיפטה אש מלוטש זכוכית resuspend התאים.
- לאחר ספירתing התאים, צלחת אותם בצפיפות הרצויה בצלחת 24 באר. בדרך כלל אנחנו צלחת 10 תאים / μL ידי מילוי כל הבאר הראשונה עם בינוני ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה התא כדי לקבל נפח סופי של 500 μL של התקשורת.
- מניחים את צלחת 37 ° C-CO 2 באינקובטור בו לא יועברו עד לספור את תחומי המתעוררות לאחר 7 ימים.
3. תוצאות של בידוד בתאי גזע רשתית
- כאשר הליך זה מבוצע בהצלחה, התאים גזור אפיתל ריסי אמור להיראות כך לאחר הפרידו מצופה בצפיפות נמוכה (איור 1).
- לאחר 7 ימים בתרבית, תאים ברשתית גזע תחומי שעולות נספרים. כדור צריך להיות מעל 75 מיקרומטר בקוטר חופשי צף להיות נחשב לתא גזע בתחום הנגזרים. (איור 2). עם זאת, תאים מסוימים תהיה מוגבלת התפשטות טופס spheroids שאינן עומדות בקריטריון הגודל לא ייספרו כתא גזע שמקורם התחומים; דוגמה spheroid כזה מוצג כאן (איור 2).
4. נציג תוצאות
באיור 1.
איור 2.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן האפיתל של ריסי העיניים העכבר 1-3. המתודולוגיה בשביל לבודד את רצועות של אפיתל ריסי יכול להשתנות, אולם אנזימים מתודולוגיה להשגת השעיה תא בודד מוטבו בפרוטוקול זה. חשוב גם כי רצועות של אפיתל ריסי שהיו מבודדים אינם מכילים כמויות גדולות של הרשתית או קרנית שכן אלה נראה שיש השפעה שלילית על המספר הכולל של הכדורים כי יכול להיות מבודד כל עין. בנוסף, סרום ללא התקשורת כי אנו עושים זאת גובשה במקור עבור המוח neurospheres 13, הוא אידיאלי לגידול תאים ברשתית תחומי גזע. כדאי גם לוודא כי התאים לא מוטרדים אחרי שהם כבר מצופה והניח בחממה כך הספירות גדל אינם מצטברים יחד 14.
ברגע שתאי הגזע רשתית יצרו תחומי המשובטים, הם יכולים לסמוך כדי לקבל מספר פוטנציאלי של בתאי גזע לכל עין. הכדורים ואז לאחר מכן ניתן ניתק לתוך תאים בודדים passaged עצמית חידוש יכולות לקבוע או מובחן לתוך תאים מסוגים שונים של הרשתית הרשתית העצבית באמצעות שילובים שונים של גורמי גדילה ו / או חלבונים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים לורה קלארק סיוע שלא יסולא בפז שלה. עבודה זו נתמכת על ידי NCE: רשת לתאי גזע, CIHR ו-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
- Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
- Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
- Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
- Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
- Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).
- Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
- Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).
- Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
- Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).
- Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).
- Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).
- Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).
- Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. , 208-201 (1999).
- Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
