Summary
В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз и вырастить их в культуру в форме клональной сетчатки сферах. Сферах, которые изолированы обладают кардинальные свойства стволовых клеток: самообновлению и multipotentiality.
Abstract
Взрослых мышей стволовые клетки сетчатки (РКК) является редким покоя клетка найти в ресничного эпителия (CE) из глаза у млекопитающих 1,2,3. CE состоит из непигментированной внутренних и внешних слоев пигментированные клетки, и клональной РКК колоний, которые вытекают из одного пигментированные клетки от CE состоят как пигментированные и не пигментированные клетки, которые могут быть дифференцированы по форме все типы клеток нервной сетчатки и ПЭС. Существует некоторая полемика о том, все клетки в сферах содержат по крайней мере некоторые пигмента 4, однако клетки все еще способны образовывать различные типы клеток найдены в нейронных сетчатки 1-3. У некоторых видов, например, земноводных и рыб, их глаза способны к регенерации после травмы 5, однако, глаза у млекопитающих не показывает таких регенеративные свойства. Мы стремимся к выявлению стволовых клеток в естественных условиях и понять механизмы, которые держат млекопитающих сетчатки стволовыми клетками покоя 6-8, даже после травмы, а также использовать их как потенциальный источник клеток, чтобы помочь восстановить физические или генетические модели повреждения глаз путем трансплантации 9-12. Здесь мы опишем, как изолировать цилиарной эпителиальные клетки мыши глаз и вырастить их в культуру, чтобы сформировать клональной сетчатки сферах стволовых клеток. С Есть не известные маркеры стволовых клеток в живом организме, эти сферы являются единственным известным способом перспективно выявление населения стволовых клеток в ресничного эпителия глаза.
Protocol
1. Подготовка Пройдя Решения и ферментов Решения
- Сделать искусственное спинно-мозговой жидкости (ACSF) и сыворотки среде заранее и поставить в холодильник.
- Отвешивать кинуреновой кислота (0,2 мг / мл) и растворяют в 10 мл Хило ACSF в 37 ° С водяной бане заранее, поскольку она не растворяются.
- Отвешивать трипсина (1,33 мг / мл) и гиалуронидазы (0,67 мг / мл) и место в одном 15 мл трубку и держать его при температуре -20 ° C до необходимости. Добавить кинуреновой раствора кислоты на эту трубу и фильтр, используя шприц 22 мкм фильтр непосредственно перед использованием.
- Отвешивать ингибитор трипсина (Ovamucoid: 1 мг / мл) и растворяют в теплой сыворотки среде и фильтр, используя 22μm фильтр шприца.
- Сделать покрытие СМИ: сыворотки среде содержащей FGF2 (10 нг / мл) и гепарин (2 мкг / мл).
2. Изоляция стволовых клеток сетчатки от мыши глаз
- Выделение стволовых клеток сетчатки выполняется в конкретных стерильной комната, посвященная первичных экспериментов культуры. Перед началом этой процедуры, создать микроскоп и рассекает холодный источник света, а затем выложить стерильной рассекающих инструментов. Каждый вытяжки горячего бусинка стерилизатор для стерилизации инструментов между шагами.
- Мы будем изолировать стволовые клетки сетчатки от глаз, которые были размещены непосредственно в стерильную чашку Петри, содержащих искусственные спинно-мозговой жидкости (ACSF) после их удаления из мышей, забитых в соответствии с утвержденными животных этики протоколов.
- Под микроскопом рассекает, чистые глаза щипцами: избавиться от волос и соединительной ткани, которая крепится к роговицы / склеры границы. Затем перенесите глаза на новое блюдо с ACSF.
- Хотя нежно держа глаз стационарных щипцами зубчатые, использовать угловые микро-рассечение ножницами для удаления глазных мышц. Удалить зрительного нерва, а если он еще привязаны к глазу. Постарайтесь не хлюпать глаз во время этого процесса. Передача глаза на новое блюдо с ACSF.
- Следующая использовать изогнутые микро-рассечение ножницами резать глаз пополам: начинаются в зрительный нерв и прорезать середину роговицы, встреча назад на зрительный нерв, где сокращение было начато. Это идеальное место, если две части глаза являются примерно такими же размерами, потому что это сделает следующий шаг легче.
- Холдинг роговицы с помощью двух пинцетом, осторожно очистите глаза две половины друг от друга. Выньте и выбросьте линзы, внутренних органов и нервной сетчатки глаза от снарядов. Передача снаряды новое блюдо с ACSF.
- Теперь мы готовы выделить ресничного эпителия. Во-первых, ориентироваться глаз оболочку, так что роговица справа от вас и пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) находится на левой. Аккуратно контактный глаз оболочку вниз с прямыми щипцами на стороне ППД.
- Затем с помощью скальпеля, чтобы сократить роговицы и радужной оболочки глаза от ресничного эпителия глаза, осторожно нажимая на скальпель, а не использовать распиловки движений.
- После этого, вырезать реснитчатого эпителия от ППД. Использовать не зубчатые щипцы для передачи полосу реснитчатого эпителия в новый 35-мм блюдо с ACSF.
- Таким же образом, изолировать реснитчатого эпителия из другой оболочки глаза.
- Как только оба ресничного эпителия полосы были собраны, передача полос, на 35-мм блюдо, содержащий 2 мл Dispase. Место блюдо с полосами в 37 ° C инкубаторе в течение 10 минут.
- Через 10 минут, передача полосы от Dispase в чашку, содержащий 2 мл отфильтрованной трипсина, гиалуронидазы и кинуреновой кислоты. Место блюдо при температуре 37 ° С в течение 10 минут.
- Теперь вернемся к рассекает микроскопом. Удерживая склеры вниз с прямыми щипцами, используйте нижнюю часть изогнутой не-зубчатыми щипцами аккуратно очистить реснитчатого эпителия от склеры.
- Удалить из склеры блюдо. Все, что нужно оставить в блюдо теперь клетки интересов и раствора фермента.
- Использование огневой полировкой хлопка подключен пипетки, передачи этого решения в 14-мл трубки. Растирают это решение в 30 раз разбиваются на части эпителиальных клеток, мягко заставляя решение в и из пипетки.
- Центрифуга трубки в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту. При центрифугировании будет сделано, удалить трубку из центрифуги осторожно, поскольку клетки склонны к отрываясь дне пробирки на данном этапе.
- Аккуратно аспирата большинство супернатант использованием огневой полировкой пипетки, а затем добавьте 1 мл ингибитора трипсина в сыворотке свободного СМИ к клеткам. Используйте небольшие скважины хлопка подключен пипеткой измельченного в порошок образца примерно в 50 раз, пока не будет одного-клеточной суспензии.
- Центрифуга трубке снова в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту.
- Удалить супернатант и заменить его на 1 мл ваш покрытие среды. Измельченного в порошок мягко использованием пожарной полированное стекло пипетки для ресуспендирования клеток.
- После графаING клеток, их на пластины требуемой плотности в 24-луночного планшета. Мы обычно пластины 10 клеток / мкл, заполняя каждую лунку первым со средним и последующим добавлением суспензии клеток для получения конечного объема 500 мкл СМИ.
- Место пластины в 37 ° C CO 2 инкубаторе, где она не будет перенесена, пока вы рассчитываете сферах, которые возникают через 7 дней.
3. Результаты выделения стволовых клеток сетчатки
- Когда эта процедура выполнена успешно, расчлененный цилиарной эпителиальных клеток, должна выглядеть следующим образом после того, как диссоциированных и покрытие при низкой плотности (рис. 1).
- Через 7 дней в культуре, сетчатки стволовыми клетками сферах, которые возникают, подсчитываются. Сфере должно быть более 75 мкм в диаметре и свободно плавающего будет считаться стволовых клеток производных сфере. (Рис. 2). Тем не менее, некоторые клетки будут иметь ограниченный сфероидов распространения и формы, которые не соответствуют критерию размера и не будет считаться стволовых клеток производных сферах; примером такого сфероида показана здесь (рис. 2).
4. Представитель Результаты
Рисунок 1.
Рисунок 2.
Discussion
Этот протокол описывает, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз 1-3. Методология выделения полос реснитчатого эпителия может меняться, однако ферменты и методологию для достижения одной клеточной суспензии были оптимизированы в этом протоколе. Важно также, что полосы реснитчатого эпителия, которые были изолированы не содержат большого количества НПП или роговицы, так как эти, как представляется, негативное влияние на общее число сфер, которые могут быть изолированы друг от друга глаз. Кроме того, сыворотки среде, что мы делаем, которая была первоначально разработана для мозга нейросферы 13, идеально подходит для выращивания сетчатки сферах стволовых клеток. Следует также убедиться, что клетки не нарушается после того как они были покрыты и поместили в инкубатор, чтобы растущие сферы не совокупный вместе 14.
После сетчатки стволовыми клетками сформировали клональной сферах, их можно пересчитать, чтобы получить перспективные количество стволовых клеток в глазу. Сферы, то может быть отделена в одиночных камерах и пассировать выяснить самообновлению возможности или дифференцировались в различные типы клеток нервной сетчатки и ПЭС, используя различные комбинации факторов роста и / или белков.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Лаура Кларк за ее неоценимую помощь. Эта работа проводится при поддержке NCE: Стволовые клетки сети, CIHR и NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
- Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
- Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
- Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
- Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
- Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).
- Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
- Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).
- Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
- Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).
- Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).
- Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).
- Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).
- Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. , 208-201 (1999).
- Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
