Summary
Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l'auto-renouvellement et multipotentiality.
Abstract
Les souches de souris adultes des cellules rétiniennes (RSC) est une cellule quiescente rares trouvées dans l'épithélium ciliaire (CE) de l'œil des mammifères 1,2,3. Le CE est composé de non-pigmentées intérieure et pigmentées des couches externes des cellules, et les colonies clonales SRC qui découlent d'une seule cellule pigmentée de la CE sont constitués de deux cellules pigmentées et non pigmentées qui peuvent être différenciés pour former tous les types de cellules de la rétine neuronale et le RPP. Il ya une certaine controverse quant à savoir si toutes les cellules au sein des sphères contiennent tous au moins quelques pigments 4, mais les cellules sont encore susceptibles de former les différents types de cellules trouvées au sein de la rétine neurale 1-3. Chez certaines espèces, comme les amphibiens et les poissons, leurs yeux sont capables de régénération après une blessure 5, toutefois, les yeux des mammifères montre pas de telles propriétés régénératrices. Nous cherchons à identifier les cellules souches in vivo et de comprendre les mécanismes qui maintiennent les cellules souches rétiniennes de mammifères repos 6-8, même après des blessures ainsi que de les utiliser comme une source potentielle de cellules pour aider à la réparation des modèles physiques ou génétiques des lésions oculaires par la transplantation 9-12. Nous décrivons ici comment isoler les cellules épithéliales ciliaires de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture afin de former la rétine sphères clonale de cellules souches. Comme il n'existe pas de marqueurs connus de la cellule souche in vivo, ces sphères sont le seul moyen connu d'identification prospective de la population de cellules souches au sein de l'épithélium ciliaire de l'œil.
Protocol
1. Préparer les solutions de dissection et de solutions enzymatiques
- Faites le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) et les médias sans sérum à l'avance et réfrigérer.
- Peser l'acide kynurénique (0,2 mg / ml) et dissoudre dans 10 ml de hilo ACSF au bain-marie à 37 ° C à l'avance car il ne se dissolvent pas facilement.
- Peser la trypsine (1,33 mg / mL) et de hyaluronidase (0,67 mg / mL) et le lieu dans un tube de 15 ml et le conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Ajouter la solution d'acide Kynurenic à ce tube et le filtre à l'aide d'un filtre 22 um seringue juste avant l'utilisation.
- Peser inhibiteur de la trypsine (Ovamucoid: 1 mg / mL) et dissoudre dans chaude milieu sans sérum et le filtre en utilisant un filtre seringue 22μm.
- Faire les médias placage: un milieu sans sérum contenant FGF2 (10 ng / ml) et l'héparine (2 pg / ml).
2. Isoler des cellules souches rétiniennes de l'Oeil de la souris
- L'isolement des cellules souches rétiniennes est effectuée dans un local spécifique dédié aux expériences stériles culture primaire. Avant de commencer cette procédure, mis en place le microscope à dissection froide et source de lumière, puis disposer les instruments stériles dissection. Chaque hotte est un stérilisateur à chaud de perles pour stériliser les instruments entre les étapes.
- Nous allons isoler les cellules souches rétiniennes dans les yeux qui ont été immédiatement placés dans une boîte de Pétri stérile contenant artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF) après leur retrait de souris sacrifiées en fonction de protocoles approuvés éthique animale.
- Sous la loupe binoculaire, nettoyer l'œil avec une pince: se débarrasser de la chevelure et le tissu conjonctif qui est attaché à la cornée / frontière scléral. Puis transfert à l'œil d'un nouveau plat avec l'ACSF.
- Tout en douceur en maintenant l'œil fixe avec des pinces dentelées, l'utilisation de micro-dissection angle de ciseaux pour retirer les muscles oculaires. Retirez le nerf optique ainsi si elle est toujours attachée à l'œil. Essayez de ne pas écraser l'œil au cours de ce processus. Transfert yeux pour un nouveau plat avec l'ACSF.
- Suivant l'utilisation de micro-dissection courbes des ciseaux pour couper l'œil dans la moitié: commencer au nerf optique et couper par le milieu de la cornée, réunion de retour au nerf optique où la coupe a été lancé. Il est idéal si les deux morceaux de l'œil sont à peu près équivalente en taille car cela rendra plus facile la prochaine étape.
- Tenir les cornées l'aide de deux pinces, retirez délicatement l'œil les deux moitiés de l'autre. Retirez et jetez les lentilles, les viscères, et la rétine neurale à partir de coquilles oeil. Transférer les coquilles dans un plat avec les nouveaux ACSF.
- Maintenant nous sommes prêts à isoler l'épithélium ciliaire. Pour commencer, orienter la coquille des yeux afin que la cornée est sur votre droite et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est sur la gauche. Délicatement la coquille broches oeil vers le bas avec une pince sur le côté droit du RPP.
- Ensuite, utiliser un scalpel pour couper la cornée et l'iris loin de l'épithélium ciliaire de l'œil en appuyant doucement sur le bistouri plutôt que d'utiliser mouvements de sciage.
- Après cela, couper l'épithélium ciliaire loin de l'EPR. Utilisez une pince non dentelé de transférer la bande de l'épithélium ciliaire à une nouvelle de 35 mm plat contenant ACSF.
- De la même façon, isoler l'épithélium ciliaire de la coquille autre œil.
- Une fois les deux bandes ciliaires épithéliales ont été recueillies, le transfert des bandes dans un plat de 35 mm contenant 2 ml de dispase. Placer le plat avec les bandes dans un incubateur à 37 ° C pendant 10 minutes.
- Après 10 minutes, transférer les bandes de la dispase dans un plat contenant 2 ml de trypsine filtré, hyaluronidase, et l'acide kynurénique. Placer le plat à 37 ° C pendant 10 minutes.
- Revenez maintenant à la loupe binoculaire. Tout en tenant le bas de la sclère avec une pince droite, utiliser le bas de la incurvé non dentelé des forceps pour gratter délicatement l'épithélium ciliaire loin de la sclérotique.
- Retirer la sclérotique de l'antenne. Tout ce qui doit être laissé dans le plat sont maintenant les cellules d'intérêt et de la solution enzymatique.
- Utiliser un feu poli coton branchée pipette, transférer cette solution dans un tube de 14 ml. Triturer cette solution 30 fois pour briser les cellules épithéliales en douceur forçant la solution dans et hors de la pipette.
- Centrifuger le tube pendant 5 minutes à 1500 RPM. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le tube de la centrifugeuse avec soin, car les cellules sont enclins à se détacher du fond du tube à ce stade.
- Doucement aspirer la majorité des surnageant avec une pipette polie au feu, puis ajoutez 1 ml d'inhibiteur de la trypsine dans un milieu sans sérum pour les cellules. Utilisez un petit coton branchée forage pipette de triturer l'échantillon d'environ 50 fois jusqu'à ce qu'elle soit une suspension à cellule unique.
- Centrifuger le tube à nouveau pendant 5 minutes à 1500 RPM.
- Enlever le surnageant et le remplacer par 1 mL de votre milieu d'étalement. Triturer doucement à l'aide d'une pipette en verre poli au feu pour remettre les CELLS.
- Après comptage des cellules, plaque eux à la densité désirée dans une plaque de 24 puits. En général, nous plaque 10 cellules / uL en remplissant chaque puits d'abord avec support et en ajoutant ensuite la suspension de cellules pour obtenir un volume final de 500 pl de médias.
- Placer la plaque dans un 37 ° C CO 2 incubateur où il ne sera pas déplacé jusqu'à ce que vous comptez les sphères qui surviennent après 7 jours.
3. Résultats pour isoler des cellules souches rétiniennes
- Lorsque cette procédure est effectuée avec succès, le disséqué ciliaire des cellules épithéliales devrait ressembler à ceci après avoir été dissocié et étalées à faible densité (figure 1).
- Après 7 jours de culture, les sphères de cellules souches rétiniennes qui se posent sont comptés. Une sphère doit être plus de 75 um de diamètre et flottant à être compté comme une cellule souche dérivée sphère. (Figure 2). Toutefois, certaines cellules ont limité la prolifération et la forme de sphéroïdes qui ne satisfait pas au critère de taille et ne seront pas comptés comme des sphères de cellules souches dérivées; un exemple d'un tel sphéroïde est montré ici (figure 2).
4. Les résultats représentatifs
Figure 1.
Figure 2.
Discussion
Ce protocole décrit comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de souris 1-3. La méthodologie utilisée pour isoler les bandes de l'épithélium ciliaire peut varier, cependant les enzymes et la méthodologie permettant d'atteindre une suspension à cellule unique ont été optimisés dans ce protocole. Il est également important que les bandes de l'épithélium ciliaire qui ont été isolés ne contiennent de grandes quantités de RPE ou cornée puisque ceux-ci semblent avoir un impact négatif sur le nombre total des sphères qui peuvent être isolés de chaque œil. En outre, les milieux sans sérum que nous faisons qui a été initialement formulé pour le cerveau neurosphères 13, est idéal pour la culture de cellules souches rétiniennes sphères. On devrait également s'assurer que les cellules ne sont pas perturbés après avoir été plaqué et placés dans l'incubateur afin que les sphères de plus en plus ne s'agrègent pas ainsi 14.
Une fois les cellules souches rétiniennes ont formé des sphères clonale, elles peuvent être comptées pour obtenir un nombre potentiel de cellules souches par œil. Les sphères, puis peuvent ensuite être dissociés en cellules individuelles et passages pour vérifier les capacités d'auto-renouvellement ou différenciée selon les types de cellules différentes de la rétine neuronale et RPE en utilisant différentes combinaisons de facteurs de croissance et / ou des protéines.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Laura Clarke pour son aide inestimable. Ce travail est soutenu par des RCE: Réseau de cellules souches, les IRSC et les NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
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