Profilering van de Pre-micro-RNA's en microRNA's met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Summary

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Abstract

Kwantitatieve real-time PCR (QPCR) heeft ontpopt als een nauwkeurig en waardevol instrument in de profilering van genexpressie niveaus. Een van de vele voordelen is een lagere detectiegrens in vergelijking met andere methoden van gen expressie profilering tijdens het gebruik van kleinere hoeveelheden input voor elke test. Geautomatiseerde qPCR setup is verbeterd op dit gebied door toe te staan ​​voor een grotere reproduceerbaarheid. De handige en snelle setup zorgt voor high-throughput experimenten, waardoor de profilering van vele verschillende genen tegelijkertijd in elk experiment. Deze methode in combinatie met interne controle plaat vermindert ook de experimentele variabelen bij andere technieken. We hebben recent ontwikkelde een qPCR test voor profilering van pre-microRNA's (pre-miRNAs) met behulp van een set van 186 primer paren. MicroRNA hebben zich ontwikkeld tot een nieuwe klasse van kleine, niet-coderende RNA's met de mogelijkheid om vele doelen mRNA regelen bij de post-transcriptionele niveau. Deze kleine RNA's worden eerst getranscribeerd door RNA polymerase II als een primaire miRNA (pri-miRNA) transcriptie, die vervolgens wordt gesplitst in de voorloper miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNAs worden geëxporteerd naar het cytoplasma waar Dicer knipt de hairpin loop te geven volwassen miRNAs. Verhogingen van miRNA niveaus kunnen worden waargenomen op zowel de voorloper en volwassen miRNA niveaus en profilering van beide vormen kan nuttig zijn. Er zijn verschillende commercieel verkrijgbare assays voor de rijpere miRNAs, maar de hoge kosten kunnen afschrikken onderzoekers van deze profilering techniek. Hier bespreken we een rendabele, betrouwbare, SYBR-based qPCR methode van profiling pre-miRNAs. Veranderingen in de pre-miRNA het niveau vaak een weerspiegeling van volwassen miRNA veranderingen en kan een nuttige indicator van de volwassen miRNA expressie. Kan echter gelijktijdig profilering van zowel pre-miRNAs en volwassen miRNAs worden optimaal als ze kunnen nonredundant informatie bijdragen en geven inzicht in de verwerking van microRNA. Bovendien kan de techniek hier beschreven worden uitgebreid met de profilering van andere bibliotheek sets voor specifieke studierichtingen of ziekteverwekkers omvatten.

Protocol

De qPCR pre-miRNA profilering arrays kunnen worden opgezet als volledig geautomatiseerd met een Tecan Freedom Evo robot (A) of met de hand met de Matrix elektronische multichannel pipet (B).

1) Maak de master mix, primer platen en samples.

1. Primer platen met 186 primerparen in 96-well formaat (totaal 2 platen) op 12:05 moeten worden opgeslagen bij -80 ° C. Dooi platen uit bij kamertemperatuur, vortex en centrifugeer kort voor gebruik.
2. Ter voorbereiding op de master-mix, ontdooien SYBR Green 2x PCR-mix bij kamertemperatuur. Elke reactie maakt gebruik van 8ul master mix met 2ul primer. De samenstelling van de master mix per reactie is 4UL SYBR mix, 3ul PCR kwaliteit water en 10-20 ng DNA-monster of cDNA.
3. Voor de installatie van elke 96-well plaat primer, zullen vier master mix buizen nodig zijn. Monsters kunnen worden uitgevoerd 4 monsters per plaat (singlicate), 2 monsters per plaat (duplicaat) of een enkele sample in viervoud.
4. Bereid Master Mix door het combineren van SYBR, water-en monster in elk van de 4-2 ml Eppendorf buizen. Elke buis moet voldoende master mix voor ongeveer 100 reacties, waardoor risico voor pipetteren afval. Vortex te mengen.

A. Instellen van de pre-miRNA test met behulp van de Freedom Tecan Evo robot.

1. Na initialisatie van de robot en laden van de Evoware programma, spoel drie keer met 30mls elk systeem vrij van luchtbellen die interfereren met pipetteren nauwkeurigheid.
2. Het instellen van de robot platform om het volgende omvatten:
   • Gelabeld 384-wells plaat
   • 96-well plaat primer (1)
   • Mastermengsels
   • Een buis met 2% bleekwater
   • Een gevulde systeem vloeistofcontainer
   • Lege afvalcontainer
3. Begin geautomatiseerde robot gerund door te kiezen voor "Run" twee keer.
4. Aan het einde van het programma, verwijder 384-wells plaat en afdichting met LightCycler 480 afdichting folie en centrifuge kort. Plaats verzegelde 384-wells plaat in positie 1 van het hotel.
5. Ga naar 2.2 stap en voor primer plaat 2 te herhalen met een nieuwe meester mixen en een nieuwe 384-wells plaat.
   1. Plaats verzegeld plaat in positie 2 van het hotel.
6. Open nieuwe Evoware programma voor het laden van LightCycler van het hotel en kies twee keer "Run".
   1. Freedom Evo zal elke plaat automatisch laden in de LightCycler en voer de volgende SYBR-groen I / HRM fiets-programma:
      Pre (een cyclus):
      50 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
      95 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
      Amp (45 cycli):
      95 ° gedurende 15 sec bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
      62 ° gedurende 30 seconden op oprit snelheid van 2,5 ° / sec
      (Single data-acquisitie tijdens deze stap)
      Smeltcurve:
      95 ° gedurende 5 sec bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
      60 ° gedurende 1 minuut bij ramp snelheid van 2,5 ° / sec
      95 ° continue op oprit snelheid van 0,11 ° / sec
      met 5 overnames per ° C
      Cool:
      50 ° gedurende 30 seconden op helling van 25 ° / sec

B. Instellen van de pre-miRNA test met behulp van de Matrix elektronische meerkanaalspipet:

1. Plaats de inhoud van de master mix buis 1 in een reservoir.
2. Stel de elektronische pipet 16ul van de master mix te zuigen met een 2-8ul afzien stappen, gevolgd door een zuivering stap.
3. Voor master mix 1, afzien 8ul in elke andere goed van de 384-wells plaat (ingesteld op 384-wells tip afstand), te beginnen met goed A1. (Dat wil zeggen putten A1, C1, E1, etc.) Voor de tweede 8ul afzien, ga dan naar kolom 3 (dat wil zeggen putten A3, C3, E3, etc.), dan purge boven een afvalcontainer en gooi tips.
4. Volg dit patroon voor de resterende vijf cycli totdat u bij goed A23.
5. Herhaal dit voor master mix 2, (te beginnen met goed A2, C2, E2, etc.); master mix 3 (vanaf zowel B1, D1, F1, etc.); master mix 4 (vanaf B2, D2, F2, enz. .).
6. Voor aliquotting van de primer plaat, zet elektronische pipet op 2ul aspireren en afzien 2ul met een zuivering stap na. Doseer 2ul van primers uit kolom 1 van de 96-well plaat primer (AH) in de 384-wells plaat, putten A1, C1, E1, etc. Purge meer dan een afvalcontainer en gooi tips. Herhaal dit voor putten A2, C2, E2, B1, D1, F1, en B2, D2, F2, etc.
7. Herhaal dit voor de rijen 2-12 van 96-well primers, bewegen meer dan om de 2 kolommen voor elke primer kolom, tot de volledige 384-wells plaat is aliquotted.
8. Seal-platen met een LightCycler afdichting folie en centrifuge kort.
9. Plaats platen in een LightCycler 480 en fietsen de platen op basis van de volgende instellingen met behulp van de SYBR Green I / HRM-detectie-indeling:
   Pre (een cyclus):
   50 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
   95 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
   Amp (45 cycli):
   95 ° gedurende 15 sec bij ramp ratevan 4,8 ° / sec
   62 ° gedurende 30 seconden op oprit snelheid van 2,5 ° / sec
   (Single data-acquisitie tijdens deze stap)
   Smeltcurve:
   95 ° gedurende 5 sec bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec
   60 ° gedurende 1 minuut bij ramp snelheid van 2,5 ° / sec
   95 ° continue op oprit snelheid van 0,11 ° / sec
   met 5 overnames per ° C
   Cool:
   50 ° gedurende 30 seconden op helling van 25 ° / sec
10. Herhaal dit met behulp van primer plaat 2, aliquotting in een frisse 384-wells plaat met vers bereide mastermengsels.

Geheimen van het succes:

Een belangrijk kenmerk bij het ontwerpen van PCR arrays is dat alle 186 primerparen dezelfde annealing temperatuur hebben, zodat de plaat kan worden uitgevoerd op hetzelfde optimale PCR-run programma-instellingen.

Elke nieuwe array moet worden gecontroleerd met behulp van drie controles vóór het runnen van monsters. Deze controles zijn:
Een run van alle primers lopen met water of 0,1 x TE uit te sluiten primer besmetting.
Een run van afwisselend water / TE en positieve controle, geen overdracht te verzekeren.
3 runs met dezelfde positieve controle, dat de reproduceerbaarheid tussen de runs te verzekeren.
Mastermengsels moet vers worden bereid, en de platen moeten worden uitgevoerd binnen de 24 uur voor een optimaal resultaat
Primer plaat folie dient langzaam te worden verwijderd om het risico van besmetting tussen putten te verminderen.
Bij gebruik van een robot met vaste tips, 2% bleekwater wassen is nodig om de tips tussen elke pipetteren stap, gevolgd door een waterspoeling wassen. Dit voorkomt en elimineert overdracht, die anders zouden kunnen besmetten gegevens en leiden tot een overtuigend resultaat.
Na een plaat lopen door de LightCycler, moet niet meer worden geopend in de PCR-setup kamer. Dit helpt voorkomen dat PCR-besmetting.

Representatieve resultaten:

qPCR resultaten worden meestal vertegenwoordigd door de CT-waarden zoals bepaald op basis van de LightCycler analyse software. Een succesvolle run bestaat meestal uit een reeks van CTS voor monsters, meestal tussen de 20-35 voor monsters die zijn positief. Het water monsters in een goede run zijn altijd bij een CT van> 40 en de eventuele monsters of specifieke putten met een CT meer dan 37 worden beschouwd als negatief of niet gedetecteerd. Als algemene regel geldt, monsters waardoor een CT van <10 is ook onbetrouwbaar en zijn uitgesloten van verdere analyse. Er zijn verschillende manieren om qPCR gegevens en het opnemen van interne controles te analyseren in onze test helpt bij de controle voor de variatie van het monster input. De pre-miR array bevat een U6 controle primer, die vaak wordt gebruikt als een referentie-gen naar CT waarden normaliseren van verschillende monsters. Deze genormaliseerde waarde wordt aangeduid als de delta CT-waarde (DCT). De resultaten worden vaak weergegeven als de ruwe CT, de DCT waarde of kunnen verder worden geanalyseerd om gestandaardiseerde waarden.

In figuur 1, een analyse van de volledige pre-microRNA reeks van vier verschillende monsters van een tijdsverloop experiment is gepresenteerd in heat map-formaat. De relatieve expressie van iedere pre-microRNA is getoond en drie grote, verschillende clusters ontstaan. De meerderheid van de geanalyseerde pre-Mirs onderging kleine, onbelangrijke veranderingen zoals verwacht (Figuur 1A). Er werden echter een klein deel van de pre-microRNA's aanzienlijk gedaald (figuur 1B) of enorm toegenomen (figuur 1C) het hele tijdsverloop experiment. Niveaus van expressie van iedere pre-microRNA werden genormaliseerd om de 0h meetpunt (voorbeeld 1) als een basisniveau. In sommige gevallen kunt u er rekening mee dat een deel van de geclusterde pre-microRNA's ook samen cluster in de heatmap analyse (ex: laat-7a, figuur 1B). Afhankelijk van het experiment, clusters kunnen ontstaan ​​die afhankelijk zijn van virale infectie, celtype specifieke uitdrukking is van pre-microRNA's of pre-Mirs die worden gereguleerd door een gemeenschappelijke molecuul of signaalweg.

De pre-microRNA test die we ook hebben ontwikkeld bevat een aantal bekende virale pre-microRNA's en genen die gecodeerd worden door Kaposi-sarcoom Associated herpesvirus (KSHV) en Epstein Barr Virus (EBV) in aanvulling op de menselijke pre-Mirs. Deze kunnen gebruikt worden als positieve of negatieve controles, afhankelijk van de cellijn en virale de status van de gebruikte samples. In figuur 2 zijn de gemiddelde CT uit een KSHV-negatieve monster run in viervoud getoond. Belangrijk is dat KSHV LANA niet gedetecteerd in deze steekproef door de uiterst gevoelige qPCR array. Echter, U6 - onze interne controle en-7a te laten - werd een hoge mate tot expressie menselijke pre-microRNA, uitgedrukt in detecteerbare niveaus. Ten slotte, zoals verwacht, heeft de negatieve controle van de PCR-grade water niet toegeven een qPCR product.

Een andere indicator voor een succesvolle qPCR run is een goede smeltcurve analyse, die inzicht kan geven in mogelijke besmetting in monsters. Om een ​​smelttemperatuur, wordt de plaat langzaam opgewarmd na de PCR is voltooid. Als de DNA-strengen gescheiden, is SYBR groen vrijgegeven, en fluorescentie signaal afneemt. De temperatuur waarbij deze drop komt is grafiek, en staat bekend als de smelttemperatuur van het monster. Afhankelijk van de DNA-sequentie, samples smelten bij verschillende temperaturen van elkaar en uit het water negatieve controle, die niet mogen hebben een smelttemperatuur omdat er geen DNA aanwezig is. De PCR-producten van elk primerpaar moeten smelten bij vergelijkbare temperaturen. Bijvoorbeeld, Figuur 3 toont een smeltcurve analyse voor twee verschillende primers met dezelfde monster in tweevoud. Het is duidelijk dat de smelttemperatuur is verschillend voor de twee primerparen, maar het monster aan het smelten is op exact dezelfde temperatuur voor elke repliceren. Tekenen van een slechte of mogelijk besmette monsters kan verschillende smelten pieken, wat suggereert dat de aanwezigheid van twee verschillende bronnen van input.

Figuur 1. Pre-microRNA handtekeningen ontstaan ​​door profiling met behulp van een roman qPCR-gebaseerde array. De gemiddelde deltaCTU6 was berekend en gestandaardiseerde waarden werden geladen in ArrayMinerTM software, waardoor drie verschillende clusters weergegeven als heatmaps. (A) Pre-microRNA's met kleine veranderingen in de expressie worden weergegeven. Pre-microRNA's waarvan de niveaus waren significant verlaagd (B) of verhoogd (C) worden ook getoond. Blauw komt overeen met lagere niveaus van expressie, terwijl rood staat voor verhoogde expressie niveaus.

Figuur 2. Opname van de interne controle in de qPCR-based pre-microRNA array. De ruwe CT waarden voor de 3 verschillende genen en een template geen controle worden weergegeven. U6 wordt gebruikt als een interne positieve controle tijdens het PCR-H2O fungeert als onze negatieve controle. Laat-7a-1-1 is een microRNA normaal gesproken uitgedrukt in veel verschillende soorten cellen, terwijl KSHV LANA kan gebruikt worden als een positief of negatieve controle, op basis van virale status van de cellijn of weefsel gebruikt.

Figuur 3. Smeltpiek analyse van de pre-microRNA primers en het gebrek van het monster besmetting. Smeltcurves werden verkregen met behulp van de Tm bellen analyse in de LightCycler software. Twee verschillende primers (Primer A en B) voor hetzelfde monster in duplo worden weergegeven. De smelttemperatuur van elke primer is verschillend. Echter, de steekproef heeft slechts een piek, waaruit blijkt het ontbreken van een monster besmetting.

Discussion

QPCR is een zeer gevoelige test die gebruikt kan worden om genexpressie niveaus te vergelijken tussen de monsters in een studie, alsook aan positiviteit te bepalen in het geval van virussen. Het voordeel van het gebruik van qPCR arrays is de mogelijkheid om vele primers (in ons geval, 186 primer paren) lopen voor elk monster in een korte periode van tijd. Met behulp van een robot pipetteren, zoals de Tecan Freedom Evo, de hoeveelheid tijd die nodig is om een ​​experiment up kan verder worden verlaagd ingesteld, en de nauwkeurigheid en consistentie van de robot kan verminderen en elimineren pipetteren fouten. Hier laten we zien hoe je een Tecan Freedom Evo te gebruiken om het opzetten van een microRNA array, maar ook als een alternatieve methode met behulp van een Matrix Electronic meerkanaalspipet, die kan worden geïmplementeerd voor laboratoria die geen toegang hebben tot een pipetteren robot. qPCR arrays zijn ook voordelig omdat alle genen kunnen worden genormaliseerd op een enkele set van referentie-genen op dezelfde plaat, verlagen van de kosten en het aantal reacties.

Zoals vermeld, zijn er een aantal belangrijke functies die nodig zijn bij het ontwerpen van zo'n array. Aangezien alle monsters op de PCR-plaat zal worden uitgevoerd in identieke omstandigheden, is het essentieel om het ontwerp van primers die de functie op dezelfde temperaturen en instellingen, of een primerparen zal mislukken. Bij het ontwerpen van primers, moeten de sequenties altijd worden gecontroleerd door BLAST zoeken om ervoor te zorgen dat er homologie om je gen van belang en geen andere genen.

Bij het uitvoeren van de array, is het essentieel dat de omgeving is steriel en vrij van PCR verontreinigingen die kunnen leiden tot valse positieven. Indien mogelijk, moeten PCR worden ingesteld in een steriele werk kap of een aparte schone kamer, waar de PCR-producten nooit worden gebruikt. Banken dienen te worden gewassen met Eliminase, water en ethanol, en onderworpen aan UV-licht gedurende minstens een uur na de run is voltooid.

Het voordeel van deze techniek is dat deze zelfde strategie is van toepassing voor een set van genen te profileren door simpelweg het vervangen van de miRNA array met een array met een ander primerpaar in te stellen. Ons laboratorium bevat momenteel arrays voor pre-miRNAs, KSHV, EBV, p53, en NFkB - die allemaal kunnen worden uitgevoerd in een identieke methode om de afgebeelde. De flexibiliteit van deze test laat ons lab om high-throughput-gen profilering uit te voeren snel en betrouwbaar voor alle primerparen dat we willen scherm voor.

Hier beschreven we de array met behulp van cDNA van menselijke cellijnen naar het profiel van miRNA expressie na activering gedurende een periode van tijd. In aanvulling op het karakteriseren van cellijnen, kan de array ook worden gebruikt om klinische monsters te analyseren. Na de RNA isolatie, cDNA synthese kan worden uitgevoerd, en de cDNA kan worden uitgevoerd met behulp van deze array om genexpressie te karakteriseren. Dit kan nuttig zijn bij het bepalen van virale positiviteit, of genexpressie profielen verder te karakteriseren welke genen worden gereguleerd in monsters van geïnfecteerde patiënten. Samengevat, geautomatiseerde qPCR-based arrays zijn reproduceerbaar en betrouwbaar testen die het mogelijk maken voor zeer gevoelige detectie van een breed scala van genen van weefsels en cellijnen in een tijdig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom Evo 150	Tecan Group Ltd.	30017587
Matrix Electronic Multichannel Pipette	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2001-MTX	(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)
Matrix Integrity Filter Tips, Sterile	Thermo Fisher Scientific, Inc.	7435	(or comparable tip for multichannel used)
Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master	Roche Group	04 707 516 001
Lightcycler 480 Instrument II	Roche Group	05015243001	384-well version
Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white	Roche Group	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Group	04729757001
LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software	Roche Group	05075122001
Eliminase Decontaminant	Decon Laboratories	04-355-31