Summary
Nós fornecemos um protocolo detalhado para preparar células primárias dissociada
Abstract
Aqui nós descrevemos um método para a preparação e a cultura de células primárias dissociada de embriões Drosophila gástrula. Em suma, uma grande quantidade de embriões de moscas encenado jovens e saudáveis são recolhidos, esterilizados, e depois fisicamente dissociada em uma suspensão única célula usando um homogeneizador de vidro. Depois de ser semeadas em placas de cultura ou slides câmara em uma densidade adequada em meio de cultura, essas células podem diferenciar em vários tipos de células morfologicamente-distintas, que podem ser identificadas por seus marcadores celulares específicos. Além disso, apresentamos as condições para o tratamento destas células com fita dupla (ds) RNAs para provocar knockdown do gene. RNAi em células de Drosophila eficiente primário é realizado por simplesmente banhar as células do dsRNA contendo meio de cultura. A capacidade de realizar perturbação RNAi eficaz, juntamente com outros molecular, bioquímica, análises de imagens de células, permitirá uma série de perguntas a serem respondidas em células de Drosophila primária, especialmente aquelas relacionadas ao músculo diferenciadas e células neuronais.
Protocol
1. Preparação de gaiolas voar
- Crescer Drosophila (linhagens selvagens, como Oregon-R ou qualquer genótipo) em recipientes convenientes, tais como copos de 32 oz de insetos.
- Transferência de moscas recém eclosed a grande colheita de embriões em gaiolas ou voar gaiolas população.
- Mover as gaiolas em um quarto com uma temperatura de 25 ° C e umidade de 65% ~ em uma luz de 12 h, e um ciclo de 12 h escuro para facilitar a coleta de embriões síncrona.
- Manter as moscas nas gaiolas, alimentando-os mortos colar fermento semeado em placas de melaço. Mudar as placas de melaço (com pasta de leveduras mortas) uma vez ao dia por 2-3 d.
2. Colheita de embriões síncrona
- No dia da primária de células, preparação alimentar as moscas wth placas revestidas com fermento fresco morto colar para um pré-lay h 1-2 período.
- Pouco antes do ciclo de 12 h escuro, substitua as placas pré deitou com placas de melaço doce listradas com uma quantidade mínima de pasta de levedura. Descartar a coleção pré leigos, que contém assíncrona embriões mais velhos.
- Coletar embriões por um período de 1-2 h.
- Remova as placas contendo a população relativamente síncrona de embriões e armazenar a 25 ° C por 5-6 h. Embriões será no estádio de gástrula avançados neste momento.
3. Coleta e lavagem de embriões
- Solte os embriões das placas com um pincel molhado, e enxaguar abundantemente com água da torneira morna através de um conjunto de peneiras empilhadas, de modo que os embriões recolher na peneira de malha mais fina na parte inferior. Enxaguar por alguns minutos para remover o fermento e detritos voam muito possível.
- Dica para as peneiras que os embriões se acumulam de um lado, e gentilmente lavá-las a partir da peneira para uma cesta dechorionation.
- Mover para a área de cultura de tecidos capô, sem deixar que os embriões secar.
4. Homogeneização de embriões e revestimento de células
- Esterilizar e dechorionate os embriões por imersão em 50% (vol / vol) lixívia para 5-10 min. Enxágüe os embriões fora do muro da cesta com 70% (vol / vol) de etanol. Alternativamente, lave a lixívia off embriões com água destilada antes do tratamento de etanol. Deste ponto em diante os embriões devem ser tratados em condições estéreis e no capô cultura de tecidos.
- Enxágüe os embriões completamente para remover a água sanitária e / ou etanol com água destilada autoclavada.
- Durante a etapa de dechorionation, preencher um homogeneizador Dounce com o volume apropriado de meio ambiente M3 temperatura com base na quantidade de embriões. A relação entre o volume de embriões e de meios de comunicação não deve ser superior a 0,5 ml embriões: 40 ml de mídia (ou ~ 100-200 embriões / ml).
- Coloque os embriões lavado num copo esterilizados com a quantidade de M3 media suficiente para submergir os embriões. Deixe o molho por 2-5 embriões min.
- Desmonte da cesta dechorionation e blot a malha Nitex seco com toalhas de papel esterilizados.
- Transferência dos embriões para o homogeneizador com um pincel esterilizados.
- Homogeneizar suavemente com movimentos curtos usando um pilão solta sem atingir o fundo do tubo até que todos os embriões são suspensas. Em seguida, suavemente, mas firmemente, homogeneizar com oito golpes completo. Não torça o pilão como ele se move para cima e para baixo.
- Transferir o homogeneizado em um tubo de centrifugação estéril de 50 ml cônico ou por derramamento ou pipetagem, ea tampa do tubo.
- Centrifugar por 10 min a 40g, a temperatura ambiente até o pellet restos de tecido, pedaços grandes células e membranas vitelínico. Transferir o sobrenadante contendo as células e gema para um tubo limpo e repita os passos de centrifugação por 5 min.
- Transferir cuidadosamente o sobrenadante por derramamento ou pipetando para um tubo limpo e gire por 10 minutos a 360g, temperatura ambiente, para sedimentar as células. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em 10 ml de meio de cultura (sem soro meio de experimentos RNAi).
- Contagem de células viáveis utilizando um hemocitômetro para estimar a densidade das células. Enquanto isso, repita o passo 4,10 para agregar as células.
- Volte a suspender as células a uma concentração desejada. Para começar, tente um intervalo de 1 ~ 5 x10 6 células / ml e placa para fora em 1,7-2,5 x10 5 células / cm 2.
5. Primárias de células RNAi para células cultivadas em uma placa de 384 poços
- Dispense 5 mL de dsRNAs em cada poço a uma concentração final de ~ 250 ng por poço em uma placa de 384 poços.
- Use uma pipeta multi-canal, dispensar 10 ml (1 ~ 4x106 células / ml) de pilhas por poço em meio M3 sem soro em uma placa de 384 poços contendo um dsRNA diferentes em cada poço. Alternativamente, as células podem ser cultivadas em 8 de bem-câmara de lâminas de vidro para imagens confocal.
- Centrifugar as placas durante 1 min em 300g, temperatura ambiente. Cultura as células em meio livre de soro a 25 ° C por 22 h ou a 18 ° C por 1-2 d.
- Adicionar 30 ml de soro contendo meio de cultura em cada poço. Centrifugar as placas durante 1 min em 300g, temperatura ambiente.
- Coloque as placas em câmara úmida e cultura as células primárias para um adicional de 5 ~ 7 d a 25 ° C.
- Imagem das células ao vivo ou depois de imunofluorescência.
6. Resultados representativos:
Em condições ideais, as células na cultura vai olhar saudável, com uma morfologia rodada. A cultura terá restos celulares pouco, e de 50 confluentes ~ 80% após o início do cultivo. Estas células sofrerão alterações morfológicas após ser cultivadas por um longo período de tempo. Ele normalmente leva cerca de 5-8 dias para as células na cultura a ser totalmente diferenciada, a 25 ° C. Culturas primárias de boa qualidade geralmente são julgadas por quão bem as células de interesse são diferenciados em cultura. Por exemplo, células musculares primárias muitas vezes têm uma morfologia ramo e tornar-se-like miotubos multinucleados com listra-like miofibrilas consistem de uma série de sarcômeros. Miotubos totalmente diferenciadas, normalmente de forma espontânea mover-se na cultura. Em contraste, diferenciada neurônios primários formam aglomerados com seus corpos celulares, e se conectar com outros clusters com cabos de seus axônios.
Figura 1. Pilhas sofrer alterações morfológicas após ser banhado na cultura
(A) A imagem de campo claro de pilhas direita depois de ser banhado em um poço de uma placa de 384 poços. A maioria das células são redondas e intacta e bem separados. (B) Uma imagem de campo claro da cultura de células primárias 20 horas após o plaqueamento. Pilhas já formam aglomerados (grande ponta de seta) e músculos com uma morfologia ramo-like (seta longa) pode ser reconhecida nesta fase. (C) Uma imagem de contraste de fase de cultura primária de cinco dias após o plaqueamento. A cultura parece muito mais avançada, com extensões neuronal (setas pequenas), clusters neuronal (setas grandes) e músculos (médias seta).
Figura 2. Exemplos de pilhas tratadas com dsRNAs cultivadas em uma placa de 384 poços
Pilhas foram isolados a partir da embriões portadores de Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP transgenes, em que Dmef2-Gal4 e D42-Gal4 expressão da unidade do mito-GFP nos músculos e neurônios motores, respectivamente. As células foram tratadas com dsRNAs segmentação tanto lacZ (AC) ou inflados (se) (DF). Ambos os músculos primários e de neurônios pode ser visto por GFP (A, C, D, F). As setas brancas apontam para as extensões neuronal. Faloidina coloração de actina (setas) revela uma estrutura muscular ramo, como na cultura tratada com lacZ dsRNAs (B e C), mas round-up morfologia muscular na cultura tratada com se dsRNAs (E e F). Nas imagens mescladas (C, F), os músculos estão manchadas amarelo, mas vermelho neurônios negativos mostra e suas extensões (setas brancas).
Figura 3. Micrografias confocal de músculos primários cultivados em humanos vitronectina revestido slides tampa de vidro
Músculos primários foram immunofluorescently corados com anti-Drosophila titina (KZ) (vermelho na mesclagem) e com phalloidin para actina (verde na mala direta). Os painéis de topo são o músculo controle do tipo selvagem e as de fundo são as cessões (CG31374) RNAi muscular com sarcômeros encurtado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O padrão de desenvolvimento de culturas primárias de células Drosophila pode variar muito, possivelmente devido a diversas variáveis durante o processo primário de células de preparação. Primeiro de tudo, voa usado para postura de ovos devem ser jovens (dentro de uma semana de idade) e saudável (livre de infecção viral ou bacteriana). Embriões não fertilizados ou infectado devem ser evitados, já que são inúteis e células derivadas de embriões não os pode diferenciar e só vai sobreviver por 1-2 dias. Segundo, durante o processo de homogeneização, é importante não sobrecarregar o homogeneizador com embriões demais. Sobrecarregar o homogeneizador com embriões demais vai causar um aumento na quantidade de detritos e do número de células mortas, o que acabará por comprometer a diferenciação celular. Finalmente, as células devem ser banhado em uma densidade adequada para garantir a diferenciação boa de pilhas. Descobrimos que a diferenciação de ambos os neurônios e as células musculares é drasticamente reduzido quando as células primárias são semeados, inicialmente, a uma densidade muito alta.
Para a análise fenotípica, placas de 384 poços são normalmente utilizados para cultivar células primárias para a seleção ou análise de imagem a um menor ampliação. Imagens com uma ampliação muito maior e melhor resolução pode ser alcançada por células que crescem em um slide câmara de tampa de vidro, seguido pela imagem ou células vivas ou coradas utilizando um microscópio confocal. Como a maioria das células primárias são aderentes, a área de células que crescem no poço da câmara de slides deve ser usado como uma diretriz para a estimativa de número de células e da quantidade de médio necessário para cada poço. Além disso, slides tampa de vidro-câmara pode ser revestido com matriz extracelular (ECM) proteínas, como vitronectina humanos, laminina ou colágeno IV para permitir a diferenciação de células de interesse. Por exemplo, os músculos primários diferenciam negativamente sobre o não-revestido tampa de vidro, mas bem na ECM-revestido tampa de vidro. Finalmente, a fim de reduzir autofluorescência emitida por meio de cultura, o meio de cultura regulares, como Shield e M3 Sang, deve ser substituído por uma solução fisiológica salina voar, como HL6, logo antes de imagem.
Em princípio, este protocolo pode ser usado para a preparação de pilhas de moscas com qualquer genótipos, como de homozigotos viáveis e férteis stocks mutante, e daqueles cujos embriões podem ser selecionados manualmente ou através de um classificador baseado em expressão da GFP, ou expressar tecido-específicos Gal4, genótipos UAS-gene X. Em combinação com outros métodos de experimentação, este protocolo vai permitir uma variedade de questões a serem abordadas, especialmente aqueles que estão relacionados com células diferenciadas tais como os neurônios e músculos, e são difíceis de ser resolvidos em linhagens de células cultivadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
JB foi apoiado pelo Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ foi apoiado pelo NIH / NIGMS Fellowship GM082174 F32-02. NP é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
