Summary
Nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de cellules primaires dissociées de
Abstract
Nous décrivons ici une méthode de préparation et de la culture de cellules primaires dissociées à partir d'embryons de drosophile gastrula. En bref, une grande quantité d'embryons mis en scène des mouches jeunes et sains sont collectées, stérilisée, puis physiquement dissocié en une suspension cellulaire unique à l'aide d'un homogénéiseur de verre. Après avoir été plaqué sur des plaques de culture ou des diapositives de chambre à une densité appropriée dans le milieu de culture, ces cellules peuvent se différencier en d'autres de plusieurs types de cellules morphologiquement distinctes et qui peuvent être identifiés par leurs marqueurs cellulaires spécifiques. Par ailleurs, nous présentons les conditions pour le traitement de ces cellules avec double brin (ds) ARN pour susciter inactivation génique. Efficace ARNi dans les cellules de drosophile primaire est accomplie par la simple baignant les cellules dans un milieu de culture contenant ARNdb. La capacité de mener efficacement une perturbation ARNi, avec d'autres moléculaire, analyses biochimiques, d'imagerie cellulaire, permettra une variété de questions à répondre dans les cellules de drosophile primaire, en particulier ceux liés à la musculaires différenciées et des cellules neuronales.
Protocol
1. Préparation des cages volée
- Cultivez la drosophile (souches sauvages tels que l'Oregon-R ou tout autre génotype) dans des contenants pratiques tels que des tasses d'insectes 32-oz
- Transfert mouches nouvellement eclosed à de grandes cages d'embryon de collecte ou de voler des cages de la population.
- Déplacer les cages dans une pièce avec une température de ~ 25 ° C et une humidité ~ 65% dans une lumière de 12 h et une noire de 12 h du cycle afin de faciliter la collecte d'embryons synchrone.
- Maintenir les mouches dans les cages en les nourrissant tué pâte de levure striés sur des plaques de la mélasse. Changer les plaques de la mélasse (la levure à la pâte de tués) une fois par jour pendant 2-3 d.
2. Collecte des embryons synchrones
- Le jour de l'élément primaire de préparation, nourrir les mouches wth revêtement des plaques fraîches avec de la levure a tué la pâte pour un 1-2 h de pré-lay période.
- Juste avant le cycle de 12 h d'obscurité, de remplacer les plaques pré couché avec plaques mélasse douce strié avec une quantité minimale de pâte levure. Jeter la collection pré laïcs, qui contient asynchrones embryons âgés.
- Recueillir des embryons pour une période de 1-2 h.
- Retirez les plaques contenant de la population relativement synchrones d'embryons et les conserver à 25 ° C pendant 5-6 h. Les embryons seront au stade avancé gastrula à ce moment.
3. Collecte et lavage des embryons
- Desserrer les embryons à partir des plaques avec un pinceau humide, et rincez abondamment à l'eau du robinet tiède à travers une série de tamis empilés, de sorte que les embryons de recueillir dans le tamis plus fins treillis au fond. Rincer pendant quelques minutes pour enlever autant que la levure et les débris volent que possible.
- Astuce du tamis afin que les embryons s'accumulent d'un côté, et les laver en douceur du tamis dans un panier dechorionation.
- Déplacer vers la zone de culture de tissu capuche sans laisser les embryons se dessécher.
4. Homogénéisation des embryons et des cellules de plaquage
- Stériliser et dechorionate les embryons en les immergeant dans 50% (vol / vol) javel pendant 5-10 min. Rincez les embryons sur le mur du panier avec 70% (vol / vol) d'éthanol. Sinon, laver l'eau de Javel hors embryons avec l'eau distillée avant traitement à l'éthanol. De ce point embryons partir doivent être manipulés dans des conditions stériles et dans la hotte de culture de tissus.
- Rincez les embryons à fond pour enlever l'eau de Javel et / ou de l'éthanol avec de l'eau distillée en autoclave.
- Pendant l'étape dechorionation, remplissez un homogénéisateur Dounce avec le volume approprié de milieu M3 température ambiante en fonction du montant des embryons. Le rapport entre le volume des embryons et celle des médias ne devraient pas être trop embryons de 0,5 ml: 40 ml, les médias (ou ~ 100 à 200 embryons / ml).
- Placer les embryons rincés dans un bécher stérilisés avec le montant de M3 assez de journalistes pour submerger les embryons. Laissez tremper pendant les embryons 2-5 min.
- Démonter le panier dechorionation et éponger le filet Nitex sécher avec des serviettes en papier stérilisé.
- Transfert des embryons dans l'homogénéisateur avec un pinceau stérilisé.
- Homogénéiser doucement avec des mouvements courts en utilisant un pilon lâches sans atteindre le fond du tube jusqu'à ce que tous les embryons sont suspendus. Puis doucement, mais fermement, homogénéiser avec huit coups plein. Ne pas tourner le pilon comme il se déplace de haut en bas.
- Transférer le broyat dans un stérile de 50 ml, tube à centrifuger conique soit par versement ou de pipetage, et le bouchon du tube.
- Centrifuger pendant 10 min à 40g, la température ambiante pour obtenir un culot de débris de tissu, des bouquets à grandes cellules et les membranes vitelline. Transférer le surnageant contenant les cellules et le jaune dans un tube propre et répétez l'étape de centrifugation pendant 5 min.
- Soigneusement transférer le surnageant par pipetage versant ou dans un tube propre et de spin pendant 10 min à 360g, la température ambiante à un culot cellulaire. Jeter le surnageant. Resuspendre la cellule dans 10 ml de milieu de culture granulés (milieu sans sérum pour des expériences de RNAi).
- Nombre de cellules viables en utilisant un hémocytomètre pour estimer la densité cellulaire. Pendant ce temps, répétez l'étape 4.10 pour culotter les cellules.
- Resuspendre les cellules à une concentration souhaitée. Pour commencer, essayez une fourchette de 1 ~ 5 x10 6 cellules / ml et une plaque à moins 1.7 au 2.5 x10 5 cellules / cm 2.
5. Primaire à cellules ARNi pour les cellules cultivées sur une plaque de 384 puits
- Distribuer 5 pl de dsRNA dans chaque puits à une concentration finale de ~ 250 ng par puits dans une plaque de 384 puits.
- Utiliser une pipette multi-canaux, distribuer 10 ml (1 ~ 4x106 cellules / ml) de cellules primaires par puits dans un milieu sans sérum M3 dans une plaque de 384 puits contenant un ARNdb différents dans chaque puits. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées sur 8-même diapositives chambre de verre pour l'imagerie confocale.
- Centrifuger les plaques pendant 1 min à 300g, la température ambiante. Culture des cellules dans un milieu sans sérum à 25 ° C pendant 22 h ou à 18 ° C pendant 1-2 d.
- Ajouter 30 ml de milieu de culture contenant du sérum à chaque puits. Centrifuger les plaques pendant 1 min à 300g, la température ambiante.
- Placer les plaques dans une chambre humide et la culture des cellules primaires pour un supplément de 5 ~ 7 jours à 25 ° C.
- Image des cellules soit en direct ou après coloration par immunofluorescence.
6. Les résultats représentatifs:
Dans des conditions optimales, les cellules dans la culture sera une apparence saine avec une morphologie ronde. La culture aura peu de débris cellulaires, et de 50 ~ 80% confluentes après étalement initial. Ces cellules vont subir des changements morphologiques, après avoir été cultivés pendant une période de temps prolongée. Cela prend habituellement environ 5-8 jours pour les cellules de la culture pour être pleinement différenciées à 25 ° C. Bonne qualité des cultures primaires sont généralement jugés par la façon dont les cellules d'intérêt sont différenciées en culture. Par exemple, les cellules musculaires primaires ont souvent une morphologie semblable à la branche et de devenir des myotubes multinucléés avec une bande-like myofibrilles composé d'une série de sarcomères. Myotubes différenciés seront entièrement habituellement spontanément passer dans la culture. En revanche, les neurones primaires différenciées forment des grappes avec leur corps cellulaire, et se connecter avec d'autres clusters avec leurs câbles axone.
Figure 1. Les cellules primaires subissent des changements morphologiques, après avoir été plaqué dans la culture
(A) Une image en champ clair de cellules primaires à droite après avoir été plaqué dans un puits d'une plaque de 384 puits. La majorité des cellules sont rondes et intacte et bien séparés. (B) Une image en champ clair de la culture de cellules primaires 20 heures après placage. Les cellules primaires déjà former des amas (grosse flèche) et les muscles avec une morphologie semblable à la branche (flèche longue) peuvent être reconnus à ce stade. (C) Une image en contraste de phase de la culture primaire 5 jours après l'étalement. La culture ressemble beaucoup plus avancé, avec des extensions neuronales (petites flèches), des grappes de neurones (pointes de flèches grand) et les muscles (moyennes flèche).
Figure 2. Des exemples de cellules primaires traités avec dsRNA culture dans une plaque de 384 puits
Les cellules primaires ont été isolés à partir des embryons porteurs Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-GFP mito-transgènes, dans lequel Dmef2-Gal4 et D42-Gal4 l'expression de lecteur de mito-GFP dans les muscles et les neurones moteurs, respectivement. Les cellules ont été traitées avec dsRNA ciblant soit lacZ (AC) ou gonflés (si) (DF). Les deux principaux muscles et les neurones peut être vu par la GFP (A, C, D, F). Les flèches blanches point à l'prolongements neuronaux. Phalloïdine coloration de l'actine (flèches) révèle une structure musculaire branche comme dans la culture traitée avec lacZ dsRNA (B et C), mais la morphologie musculaire round-up dans la culture traitée avec si dsRNA (E et F). Dans les images fusionnées (C, F), les muscles sont colorés en jaune, mais rouge négative neurones montre et leurs extensions (flèches blanches).
Figure 3. Micrographies confocale des principaux muscles humains cultivés sur vitronectine lames recouvertes couvercle en verre
Muscles primaires ont été colorés avec immunofluorescently anti-drosophile Titin (KZ) (rouge dans la fusion) et avec la phalloïdine pour l'actine (vert à la fusion). Les panneaux supérieurs sont les muscles de contrôle de type sauvage et ceux du bas sont la Sals (CG31374) musculaire ARNi avec des sarcomères raccourcie.
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Discussion
Le schéma de développement des cultures primaires de cellules de drosophile peut varier considérablement, probablement due à des variables de plusieurs cours du processus de préparation de cellules primaires. Tout d'abord, les mouches utilisées pour la ponte doivent être jeunes (dans une semaine) et saine (exempte d'infection virale ou bactérienne). Embryons non fécondés ou infectés doivent être évités, car ils sont inutiles et des cellules dérivées de ces embryons ne peuvent pas se différencier et ne survivra que pendant 1-2 jours. Deuxièmement, durant le processus d'homogénéisation, il est important de ne pas surcharger l'homogénéisateur avec des embryons de trop. Surcharge de l'homogénéisateur avec des embryons de trop va provoquer une augmentation de la quantité de débris et le nombre de cellules mortes, qui finira par compromettre la différenciation cellulaire. Enfin, les cellules doivent être plaquées à une densité appropriée pour assurer une bonne différenciation des cellules primaires. Nous avons constaté que la différenciation des neurones et les cellules musculaires est considérablement réduite lorsque les cellules primaires sont ensemencés d'abord à une densité trop élevée.
Pour l'analyse phénotypique, des plaques de 384 puits sont généralement utilisés pour cultiver des cellules primaires pour le dépistage ou d'analyse d'imagerie à un faible grossissement. Les images avec un grossissement beaucoup plus élevés et une meilleure résolution peut être réalisé par des cellules en croissance sur une lame de chambre lamelle, suivie par l'imagerie des cellules vivantes ou non colorées à l'aide d'un microscope confocal. Comme la plupart des cellules primaires sont adhérentes, la zone de culture de cellules dans le puits de diapositives chambre doit être utilisé comme un guide pour l'estimation de deux le nombre de cellules et la quantité de milieu nécessaire pour chaque bien. En outre, les diapositives couvercle du compartiment de verre peut être enduit avec la matrice extracellulaire (ECM) des protéines telles que la vitronectine humaine, la laminine ou de collagène IV pour permettre la différenciation des cellules d'intérêt. Par exemple, les muscles principaux différencient mal sur le non-revêtement couvre-verre, mais bien sur l'ECM enduit de couverture en verre. Enfin, afin de réduire l'autofluorescence émis par un milieu de culture, le milieu de culture régulières comme bouclier et Sang M3, devrait être remplacé par un tampon volée sérum physiologique, tels que HL6, juste avant l'imagerie.
En principe, ce protocole peut être utilisé pour la préparation de cellules primaires à partir de mouches avec un génotype, telles que des homozygotes viables et fertiles stocks mutant, et de ceux dont les embryons peuvent être sélectionnées manuellement ou par un trieur basée sur l'expression de la GFP, ou exprimer tissu-spécifique Gal4, UAS-gène X génotypes. En combinaison avec d'autres méthodes d'expérimentation, ce protocole permettra une variété de questions qui seront abordées, en particulier ceux qui sont liés à des cellules différenciées comme les neurones et les muscles, et sont difficiles à aborder dans des lignées cellulaires cultivées.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
JB a été soutenue par la Damon Runyon Cancer Research Fellowship Foundation DRG-1716-1702. JZ a été soutenu par le NIH / NIGMS Bourse F32 GM082174-02. NP est un enquêteur de l'Institut médical Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
