Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम खड़ी विस्थापित प्रविष्टियाँ जिस पर प्रौद्योगिकी आधारित है microactuator सरणी के निर्माण, और इस आधार प्रौद्योगिकी दोनों दो आयामी और तीन आयामी संस्कृति में उच्च throughput यंत्रवत् गतिशील सेल संस्कृति का संचालन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित मानदंड.
Abstract
इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग, दवाओं की खोज या मौलिक कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए mechanobiological उत्तेजनाओं के संयोजन के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में व्यवस्थित जांच करने की क्षमता वर्तमान bioreactor प्रौद्योगिकियों, जो एक साथ संवर्धित कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजनाओं के एक किस्म को लागू नहीं कर सकते द्वारा सीमित है. आदेश में इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम microfabricated एक उच्च throughput प्रारूप में यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रभाव के लिए स्क्रीन के लिए डिजाइन प्लेटफार्मों की एक श्रृंखला विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल में, हम खड़ी विस्थापित पोस्ट जिस पर प्रौद्योगिकी आधारित है, और आगे प्रदर्शन कैसे इस आधार प्रौद्योगिकी दोनों दो आयामी और उच्च throughput यंत्रवत् गतिशील सेल संस्कृति का संचालन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है है की एक microactuator सरणी के निर्माण का प्रदर्शन तीन - आयामी संस्कृति मानदंड.
Protocol
ए डिवाइस विवरण और ऑपरेशन
उपकरण polydimethylsiloxane (PDMS) में बहुपरत नरम लिथोग्राफी 1 का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं, और एक साथ microfabricated सरणी भर में अलग - अलग सेल संस्कृति स्थानों में यांत्रिक स्थितियों की एक श्रृंखला पैदा करने में सक्षम हैं. इस प्रोटोकॉल, pneumatically actuated microposts की एक सरणी के निर्माण के लिए कदम पहले वर्णित हैं डिवाइस को संशोधित करने के लिए दोनों दो आयामी (2d) और तीन आयामी (3 डी) संस्कृति मानदंड में यंत्रवत् गतिशील संस्कृति को सक्षम करने के लिए कदम के द्वारा पीछा किया. उल्लिखित microfabricated मौजूदा macroscale सिस्टम पर throughput दृष्टिकोण बढ़ जाती है, और सबसे अच्छा यांत्रिक स्थितियों की एक किस्म के प्रभाव के लिए स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल है.
डिवाइस के लिए परिचालन सिद्धांत खड़ी actuated microposts की एक सरणी पर आधारित है. Microposts एक स्वतंत्र रूप से निलंबित कर दिया डायाफ्राम पर गढ़े हैं, और कर रहे हैं उठाया और actuation के डायाफ्राम (चित्रा 1) के नीचे सकारात्मक और नकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा कम है. सरणी की एक प्रमुख विशेषता यह है कि actuation डायाफ्राम के आकार अलग से एक एकल दबाव स्रोत सरणी पार ऊर्ध्वाधर displacements की एक श्रृंखला प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस सिद्धांत के लिए तेजी से एक डिवाइस के पार यांत्रिक stimulatory स्थितियों की एक बड़ी संख्या के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Schaffer एट अल द्वारा एक अनुरूप macroscale डिजाइन 2. आधार पर, हमारे डिजाइन एक दूसरी पोस्ट पर निलंबित कर दिया और lubricated सेल संस्कृति फिल्म, कोशिकाओं को उठाया लोड हो रहा है पोस्ट से अधिक संस्कृति फिल्म फिसल जाता है के रूप में 2 डी सब्सट्रेट विरूपण का अनुभव करने के लिए अनुमति भी शामिल है. वैकल्पिक रूप से, photopatterning लोड हो रहा है पोस्ट पर सेल से लदी hydrogels के एक सरणी 3D संस्कृति में कोशिकाओं के compressive उत्तेजना के लिए अनुमति देता है. इन प्रणालियों की स्थापना में विस्तृत निर्देशों का पालन करें.
बी वायवीय microactuator सरणी के निर्माण
वायवीय microactuator सरणी Fabricating बहुपरत PDMS संरचनाओं में कड़े संरेखण की आवश्यकता है. यह चुनौतीपूर्ण है, संकोचन प्रेरित संरेखण पंजीकरण त्रुटियों के कारण है. इस पते के लिए, हम एक निर्माण प्रक्रिया 'सैंडविच मोल्ड निर्माण 3' करार दिया है, को प्रभावी ढंग से इस मुद्दे पर 4 को खत्म करने के लिए दिखाया का उपयोग करें.
सामग्री तैयार
- एकल या बहु स्तरीय SU-8 विभिन्न स्तरों में से प्रत्येक के लिए स्वामी मानक प्रक्रियाओं का उपयोग cleanroom में गढ़े हैं. इन उपकरणों के लिए, स्वामी 200-400 सुक्ष्ममापी मोटी हैं, आवेदन पर निर्भर करता है. परास्नातक 80 ° सी तीन दिन के लिए उपयोग करने के लिए पूर्व hardbaked हैं.
- साफ़ गिलास स्लाइड और SU-8 स्वामी एक निर्वात चैम्बर में silanized हैं, सामग्री के लिए PDMS इलाज के आसंजन को रोकने के लिए. एक fumehood में, silanization एजेंट के 60 μL (tridecafluoro एक ,1,2,2 tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (संयुक्त रासायनिक टेक्नोलॉजीज, ब्रिस्टल, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) कक्ष में एक पेट्री डिश में pipetted है. नंगे कांच और SU-8 स्वामी चैम्बर में रखा जाता है और वैक्यूम के तहत रात भर रखा.
- दो फोम पैड (शिल्प की आपूर्ति दुकानों पर उपलब्ध है) और एक उपरि inkjet पारदर्शिता फिल्म SU 8 सैंडविच ढालना निर्माण के लिए इस्तेमाल किया मास्टर की तुलना में थोड़ा बड़ा आकार को काट रहे हैं.
सैंडविच मोल्ड निर्माण
- बहुपरत डिवाइस के प्रत्येक परत एक PDMS इस पद्धति का उपयोग करने के लिए ढाला परत की आवश्यकता है. सैंडविच ढालना निर्माण की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में प्रदान की जाती है.
- PDMS monomer और crosslinker अच्छी तरह से मानक 10:01 अनुपात में मिलाया जाता है. एक पहले से गढ़े मास्टर एसयू 8 uncured PDMS मिश्रण के 3 एमएल जमा पर हैं, और एक निर्वात चैम्बर में degassed.
- फोम पैड और SU-8 मास्टर एक Plexiglass बेस प्लेट पर रखा जाता है.
- पारदर्शिता ध्यान uncured PDMS पर उतारा है, किसी भी हवाई बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए सुनिश्चित करें. Inkjet transparencies किसी न किसी और एक चिकनी पक्ष है, और यह महत्वपूर्ण है कि चिकनी पक्ष संपर्क uncured PDMS है.
- एक silanized गिलास स्लाइड पारदर्शिता के शीर्ष पर रखा है, दूसरे फोम पैड और एक Plexiglass ऊपर थाली के नीचे है. सैंडविच फिर एक साथ clamped है एक सी दबाना का उपयोग.
- PDMS सैंडविच एक ओवन में 80 डिग्री कम से कम 4 घंटे के लिए सी ठीक हो जाता है.
- सैंडविच ओवन से निकाल दिया जाता है और क्लैंप हटाने से पहले शांत की अनुमति दी.
- दबाना हटाया है और सैंडविच disassembled, और फोम पैड का त्याग कर रहे हैं. पारदर्शिता ध्यान SU-8 मास्टर से दूर खुली है, नमूनों PDMS फिल्म बनाए रखने.
- इन नमूनों PDMS परतों और उनके हैंडलिंग पारदर्शिता परतों तो एक धूल से मुक्त वातावरण में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक वे उपयोग के लिए तैयार हैं. हम सफलतापूर्वक PDMS परतों का इस्तेमाल किया है कोई नजर हानिकारक प्रभाव के साथ दो महीने पुरानी है.
बहुपरत डिवाइस का निर्माण
टी "> microactuator सरणी के निर्माण के लिए योजनाबद्ध चित्र 2A में प्रदान की जाती है, और actuators के आपरेशन 2B और सी. आंकड़े में दिखाया गया है डिवाइस बनाना:- सब से नीचा नमूनों PDMS परत सैंडविच मोल्ड निर्माण द्वारा तैयार की है. इन प्रयोगों के लिए, परिपत्र व्यास में 600 से 1200μm लेकर पैटर्न इस्तेमाल किया गया.
- PDMS परत तो एक साफ गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरित किया है. एक प्रभामंडल निर्वहन इकाई ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ PDMS और कांच की सतहों के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है, और दो सतहों को एक दूसरे के साथ संपर्क में रखा जाता है. ढेर फिर 80 पर एक hotplate पर रखा ° सी संबंध प्रक्रिया को पूरा करने के लिए. पारदर्शिता तो दूर खुली किया जा सकता है और त्याग. इस प्रक्रिया के दौरान, नमूनों PDMS फिल्म एक कठोर सब्सट्रेट से कभी नहीं जारी की है, अलग - अलग परतों के संकोचन रोकने.
- सैंडविच ढलाई कदम है, जो SU-8 सुविधाओं और पारदर्शिता के बीच से बाहर नहीं निचोड़ा किया गया PDMS की पतली फिल्मों की सफलता के आधार पर हटाया जा करने की आवश्यकता हो सकती है. यह मैन्युअल रूप से एक स्टिरियोस्कोप के तहत एक 25g सुई का उपयोग किया जा सकता है है.
- दूसरा सैंडविच परत ढाला वांछित संरचना डायाफ्राम और पद का एक नकारात्मक मोल्ड प्रतिकृति के रूप में बनाई है. यह है क्योंकि बड़े क्षेत्र SU-8 स्वामी के निर्माण के चुनौतीपूर्ण है, लेकिन वैकल्पिक निर्माण प्रक्रिया का उपयोग इस अतिरिक्त कदम को समाप्त कर सकता है. इस प्रदर्शन में है, व्यास में गोल पोस्ट 500 सुक्ष्ममापी इस्तेमाल किया गया. नकारात्मक प्रतिकृति मोल्ड silanized है, और अस्थायी रूप से एक गिलास स्लाइड पर डबल पक्षीय टेप का उपयोग चिपका. Uncured PDMS जमा है, degassed और 1000 आरपीएम पर इस 45 सेकंड के लिए सैंडविच मोल्ड परत पर स्पिन - लेपित, एक actuation 60 सुक्ष्ममापी मोटी डायाफ्राम उपज. स्पिन लेपित PDMS परत 80 पर आंशिक रूप से ठीक · सी ~ 20 मिनट के लिए, या जब तक PDMS चिपचिपा है, लेकिन करता ख़राब जब छुआ नहीं स्थायी रूप से.
- गिलास स्लाइड और डबल पक्षीय टेप आंशिक रूप से ठीक PDMS परत है, जो है तो प्लाज्मा इलाज, औंधा और एक कस्टम निर्मित aligner में रखा से हटा रहे हैं. aligner एक निर्वात micromanipulator (Siskiyou, मिशन Viego, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) के लिए मुहिम शुरू चक के होते हैं. पहली परत PDMS तो प्लाज्मा इलाज और एक रोटरी चरण पर रखा (न्यूमार्क, अनुदान के पास, या, संयुक्त राज्य अमेरिका), निर्वात चक के नीचे, और दो परतों के बीच संरेखण Navitar 12x ज़ूम मशीन दृष्टि (प्रणाली Navitar का उपयोग करने के लिए मनाया जाता है; Rochester, NY, संयुक्त राज्य अमरीका).
- परतों जोड़तोड़ का उपयोग कर जुड़ रहे हैं, और ध्यान से संपर्क में लाया. सैंडविच aligner से तो निकाल दिया जाता है, और एक और आगे 30 मिनट के लिए 80 ° C पर एक ओवन में ठीक. पारदर्शिता और silanized प्रतिकृति PDMS ढालना तो डिवाइस से खुली किया जा सकता है और त्याग. डिवाइस तो पूरी तरह से 80 डिग्री कम से कम चार घंटे के लिए सी ठीक हो.
- यांत्रिक उत्तेजना प्रयोग किया जा रहा है के प्रकार पर निर्भर करता है, अतिरिक्त PDMS परतों तो उल्लिखित प्रक्रिया दोहरा द्वारा इस आधार डिवाइस के लिए कर सकते हैं बंधुआ हो. यांत्रिक उत्तेजना प्रयोगों के विभिन्न प्रकार के लिए विवरण वर्गों सी और डी में प्रदान की जाती हैं
कनेक्टर्स
- एक बार डिवाइस पूरा हो गया है, एक सुई के कनेक्शन के बिंदु पर PDMS परत को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Nanoport (Upchurch वैज्ञानिक, ओक हार्बर, WA, संयुक्त राज्य अमरीका) के रूप में वाणिज्यिक कनेक्टर्स तो बाहरी टयूबिंग के साथ इंटरफेस करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वाणिज्यिक connectors के ऊंचाई आवश्यकताओं से बचने के लिए, और इस तरह डिवाइस कंटेनर के रूप में मानक पेट्री डिश का उपयोग करने के लिए, हम के रूप में हमारे खुद बनाना.
- PDMS के लगभग 35 ग्राम डाली है और ठीक (Nunc, Rochester, NY, संयुक्त राज्य अमरीका) एक omni अच्छी तरह ट्रे में. डिवाइस खुली है, और छोटे गैसकेट वर्गों में कटौती, जिसमें से एक 1 / 8 "छेद एक पंच का उपयोग करने के लिए निकाल दिया जाता है.
- एक 18G पा सुई गैस्केट की ओर से एक अनुभाग कोर करने के लिए इस्तेमाल किया है. एक छोटे सुई 21G 18G सुई वापस लेने के पहले केंद्रीय कोर निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- PDMS के लगभग 15g डाली है और ठीक एक omni-अच्छी तरह ढक्कन ट्रे में, खुली और समान आकार अनुभाग में कटौती. स्कॉच टेप के साथ यह खंड तो साफ है, पाल बांधने की रस्सी के शीर्ष प्लाज्मा बंधुआ, और यूनिट डिवाइस के लिए प्लाज्मा - बंधुआ, छिद्रित पक्ष नीचे है.
- एक दूसरे कुंद 18G सुई तो रंग का प्लास्टिक luer संबंधक से अलग है, cored छेद में डाला और PDMS की कुछ बूंदों के साथ जगह में बंद. परिणामस्वरूप संबंधक काफी प्रभावी है, किफायती है और एक मृत अंतरिक्ष काफी बड़ी मात्रा तरल भरने चरणों के दौरान चैनलों में प्रवेश करने से हवाई बुलबुले को रोकने के है.
सी. यंत्रवत् सक्रिय 2D संस्कृति substrates
actuated microposts की सरणी के लिए एक निलंबित बहुलक फिल्म है, जिस पर कोशिकाओं सुसंस्कृत हैं में विभिन्न तनाव प्रोफाइल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक lubricated फिल्म में पोस्ट स्थापना के लिए पर्ची के लिए और पोस्ट के आसपास ख़राब फिल्म का कारण बनता है. एक equibiaxial तनाव वितरण में एक परिपत्र लोड हो रहा है पोस्ट के परिणाम का उपयोग करना, लेकिनडिजाइन कि अलग अलग पोस्ट आकार में बहुमुखी है तनाव के क्षेत्रों की एक किस्म बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 2D संस्कृति प्रयोगों (चित्रा 3 में योजनाबद्ध) के लिए actuator सरणी को संशोधित करने के लिए:
- एक तीसरे PDMS परत डिवाइस के लिए बॉण्ड के रूप में चित्रा 3a में दिखाया गया है. तीसरे PDMS परत एक दो परत संरचना के होते हैं. कम चक्र actuated microposts नीचे actuation गुहा के आकार से मेल खाता है. ऊपरी वृत्त के व्यास 100μm लोड हो रहा है पदों के व्यास से अधिक है. एक 200 सुक्ष्ममापी विस्तृत microchannel एक कनेक्शन के क्षेत्र में इन सुविधाओं जोड़ता है, और लोड हो रहा है प्रविष्टियाँ और संस्कृति फिल्म को चिकना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- बनाना और डिवाइस बंधन कनेक्टर्स, के रूप में पहले से वर्णित है.
- स्पिन कोट पारदर्शिता के चिकनी पक्ष पर एक 10-15 सुक्ष्ममापी PDMS की मोटी परत (स्पिन पैरामीटर: 4000 RPM, 120 सेकंड). कम से कम 4 घंटे के लिए 80 ° C पर इलाज.
- Appy actuators करने के लिए एक कम स्तर (Barnant एयर कैडेट आकांक्षा पंप) वैक्यूम, पदों की सरणी कम.
- प्लाज्मा इलाज के लिए और स्पिन लेपित PDMS actuated microdevice फिल्म बंधन. 80 पर एक hotplate पर प्लेस ° सी 10 मिनट के लिए. एक कम समय के लिए संस्कृति और फिल्म प्रविष्टियाँ हाइड्रोफिलिक रहेगा.
- विआयनीकृत पानी के घोल में एक 90% ग्लिसरॉल के साथ स्नेहन चैनल भरें. स्नेहन के लिए इसके अलावा, इस सूत्रीकरण PDMS के hydrophilicity अनिश्चित काल का कहना है, घर्षण गुणांक को कम करने. एयर बुलबुले पोस्ट और संस्कृति फिल्म के बीच फंस रहेगा. 40 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर डिवाइस प्लेस, और चैनल में स्नेहक इंजेक्षन करने के लिए जारी, एक छोटे से दबाव वृद्धि के कारण. कुछ ही मिनटों के बाद, हवा बुलबुले PDMS के माध्यम से फैलाना, और सभी सतहों lubricated हो जाएगा.
- नकारात्मक दबाव हटाना, पोस्ट जारी है.
- एक स्केलपेल का प्रयोग, पतली PDMS फिल्म के आसपास काटा. ध्यान से छील दूर डिवाइस से समर्थन पारदर्शिता.
- प्लाज्मा बंधन डिवाइस संस्कृति क्षेत्र के चारों ओर एक हाथ कट PDMS गैसकेट.
- 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने, और फिर 45 मिनट के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक germicidal यूवी प्रकाश के तहत डिवाइस जीवाणुरहित.
- प्लाज्मा सतह और 100 / μg एमएल कोलेजन (या वैकल्पिक ECM प्रोटीन) के साथ सेते 4 में रातोंरात डिग्री सेल्सियस का इलाज
- धो डिवाइस के साथ फॉस्फेट (पीबीएस) खारा, और कोशिकाओं 10-15000 / 2 सेमी पर बीज कोशिकाओं को मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन buffered.
Microdevice आपरेशन और जैविक प्रयोगों के इस मंच पर आयोजित की विस्तृत लक्षण वर्णन 7 अन्यत्र प्रकाशित किया गया है .
डी. यंत्रवत् सक्रिय 3D hydrogels
डिवाइस के लिए संशोधन भी photopatterned के संपीड़न सक्षम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल से लदी, एक उच्च throughput ढंग में तीन आयामी hydrogels. इस उदाहरण में, हम 350 सुक्ष्ममापी व्यास polyethylene glycol (खूंटी) hydrogel सिलेंडर बनाने के लिए, C3H10T1 / 2 माउस mesenchymal स्टेम कोशिकाओं encapsulating और compressive उपभेदों सरणी पार 5 से 25% को लेकर लागू है. इस प्रोटोकॉल और अधिक उन्नत hydrogel photopolymerization chemistries के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. तीन आयामी mechanobiology (चित्रा 4 में योजनाबद्ध) में प्रयोगों के लिए मंच का उपयोग:
डिवाइस संशोधनों:
- Parylene सी के एक 1 सुक्ष्ममापी मोटी परत गैस पारगम्यता को कम करने और खूंटी hydrogel प्रणाली में polymerization के समय में सुधार के साथ पोस्ट कोट. यह मुक्त कट्टरपंथी आधारित photopolymerization प्रतिक्रिया के साइटोटोक्सिक प्रभाव कम हो जाएगा. स्कॉच टेप के टुकड़े पोस्ट के आसपास क्षेत्रों मुखौटा के लिए उपयोग किया जाता है, और डिवाइस पीडीएस 2010 LabCoter 2 प्रणाली में लेपित है (विशेषता कोटिंग प्रणाली, इंडियानापोलिस, में, संयुक्त राज्य अमरीका).
- लेपित डिवाइस कोटिंग प्रणाली से हटा दिया जाता है, और स्कॉच टेप दूर खुली प्रविष्टियाँ अधिक Parylene सी की एक conformal परत छोड़.
- (Trimethoxysilyl) 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में propyl methacrylate - एक गिलास coverslip 3 के 2% v / v समाधान में विसर्जन द्वारा 8 methacrylated है.
- coverslip 100% इथेनॉल में rinsed है, और 100 पर पकाया डिग्री सेल्सियस, सतह पर methacrylate समूहों को छोड़कर.
- एक 200 सुक्ष्ममापी मोटी PDMS स्पेसर फिल्म एक पेट्री डिश में डाली है, और छोटे वर्गों में कटौती. इन छोटे वर्गों के चार methacrylated coverslip के किनारे के आसपास बंधुआ प्लाज्मा हैं.
- spacers तो प्लाज्मा डिवाइस के PDMS क्षेत्रों Parylene सी लेपित पदों को कवर करने के लिए बंधुआ है.
- डिवाइस 70% इथेनॉल में धोने, और 45 मिनट के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में germicidal यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के द्वारा निष्फल है.
सीटू polymerization में:
सेल से लदी खूंटी hydrogels तो photolithographically थे के रूप में 8,9 उपकरणों में नमूनों :
- और 10% w / ध् खूंटी (8kDa, सिग्मा Aldrich), एक 10% w / ध् PEGDA (अरब, अल, संयुक्त राज्य अमेरिका 3.4kDa, Laysan जैव) तैयारunsupplmented सेल संस्कृति मीडिया में समाधान.
- 1-vinyl-2-pyrolidinone में, 100 मिलीग्राम / Irgacure +२९५९ (Tarrytown, एनवाई, संयुक्त राज्य अमेरिका Ciba विशेषता रसायन) के एमएल के एक photoinitiator शेयर समाधान तैयार करें.
- अच्छी तरह से दो तैयार समाधान के साथ मिश्रण करने के लिए 0.4% w / v photoinitiator के एक एकाग्रता के साथ एक समाधान प्राप्त करने के. 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर बाँझ और particulates को दूर.
- सेल संस्कृतियों Trypsinize और संस्कृति मीडिया में दो बार वांछित अंत बिंदु सेल एकाग्रता में एक सेल निलंबन, तैयार.
- सेल और एक 1:1 के अनुपात में फ़िल्टर hydrogel समाधान / अग्रदूत photoinitiator निलंबन मिक्स.
- एक लंबे 25g सुई का उपयोग microdevice में समाधान इंजेक्षन. ध्यान डिवाइस में बुलबुले फँसाने से बचें.
- डिवाइस सतह पर संरेखण के निशान के लिए एक मुद्रित पारदर्शिता मुखौटा संरेखित करें. एक यूवी रोशनी युक्ति सतह पर 17.5 मेगावाट / 2 सेमी की एक यूवी खुराक प्रदान सिस्टम सेट. 195 एस के लिए मुखौटा के माध्यम से hydrogel रोशन इस समय हमारी प्रणाली के लिए अनुकूलित किया गया है, और को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
- पीबीएस के साथ दूर unpolymerized hydrogel अग्रदूत समाधान धो, और संस्कृति मीडिया के साथ पीबीएस की जगह. लोड हो रहा है प्रविष्टियाँ hydrogel constructs सेक उकसाना.
Microdevice संचालन और जैविक इस मंच पर किए गए प्रयोगों के विस्तृत लक्षण वर्णन कहीं 10 प्रकाशित किया गया है.
ई. परिधीय उपकरण
संशोधित पेट्री डिश उपकरणों के actuation के दौरान सेल संस्कृतियों के बाँझपन बनाए रखने के लिए किया जाता है. एक और पा छीन 18G सुई एक पेट्री डिश की ओर में drilled छेद में epoxied है. (क्ले एडम्स Intramedic PE190, VWR इंटरनेशनल, Arlington Heights, आईएल, संयुक्त राज्य अमरीका) टयूबिंग इन connectors के लिए प्रेस - फिट है और नियंत्रित solenoid वाल्व और दबाव के स्रोत को जोड़ता है.
उपकरणों के लिए दबाव बाहरी micropumps द्वारा प्रदान की जाती हैं. 2D प्रयोगों के लिए, 30-55 kPa से सकारात्मक दबाव मान एक वोल्टेज नियंत्रित सनकी डायाफ्राम पंप (Schwarzer प्रेसिजन जर्मनी सपा चुनाव आयोग नियंत्रण रेखा 500 4.5VDC) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया. एक पल्स चौड़ाई मॉडुलन आधारित वोल्टेज नियंत्रक के लिए लागू वोल्टेज भिन्न दबाव उत्पादन को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Solenoid वाल्व और manifolds (S10MM-30-12-3 और MSV10-1, Pneumadyne, प्लायमाउथ, MN, संयुक्त राज्य अमरीका) एक चक्रीय दबाव तरंग बनाने के लिए उपयोग किया जाता है. वाल्व एक 12 वी संकेत एक वर्ग तरंग समारोह जनरेटर द्वारा नियंत्रित के साथ actuated हैं.
एफ डिवाइस लक्षण वर्णन और उपयोग
डिवाइस पर इमेजिंग
इमेजिंग डिवाइस पर या कक्षों कणों के साथ एक आम मुद्दा गरीब ऑप्टिकल लोड हो रहा है पोस्ट का समर्थन PDMS फिल्म के नीचे बूंदों का संक्षेपण के कारण संकल्प है. यह संक्षेपण इनक्यूबेटर अंदर तापमान और आर्द्रता के मतभेद से निर्धारण के बाद या एक खुर्दबीन मंच पर उठता है. इस समस्या को हल करने के लिए:
- दबाव इनलेट पोर्ट के लिए एक खुला जलाशय कनेक्ट, और यह विआयनीकृत जल के साथ भरने. हम सुविधा के लिए एक luer ताला संबंधक के साथ एक खुले सिरिंज का उपयोग करें.
- डिवाइस और एक निर्वात चैम्बर में भरे जलाशय प्लेस, और नीचे पंप.
- 5 मिनट रुको, और वायुमंडलीय दबाव चैम्बर लाने. दो या तीन बार दोहराएँ. के रूप में हवा बाहर डिवाइस के चैनलों के विस्थापित है, यह जलाशय से पानी के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है, छोटी बूंद condensates को नष्ट करने और माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्पष्ट ऑप्टिकल पथ प्रदान.
- छवि संस्कृति उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग क्षेत्रों.
जीना सेल इमेजिंग के लिए, इस प्रक्रिया उपकरणों पर कोशिकाओं को बोने से पहले किया जा सकता है. हालांकि, चैनल काफी बड़े डिवाइस पर इकाइयों के बीच दबाव के किसी भी चिपचिपा नुकसान को रोकने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए.
मनका ट्रैकिंग द्वारा लक्षण वर्णन तनाव
2D संस्कृति प्रणालियों में:
- एकाग्रता के लिए वांछित मेथनॉल में, 1 सुक्ष्ममापी व्यास फ्लोरोसेंट मोती (फिशर में, बैंग्स प्रयोगशालाओं) पतला. 1:150 के मूल सांद्रता (मनका बफर समाधान में 1% ठोस) से dilutions हमारी जरूरतों के लिए उपयुक्त हो पाए थे.
- प्लाज्मा डिवाइस सतह का इलाज, और मनका निलंबन के 5-10 μL जमा.
- मेथनॉल के लिए लुप्त हो जाना करने के लिए रुको. दोहराएँ अगर मनका एकाग्रता बहुत कम है.
- छवि आराम में सेल संस्कृति क्षेत्रों, और लोड के तहत है.
- खुला स्रोत स्वचालित कण ट्रैकिंग एल्गोरिदम तो ImageJ (एनआईएच) में इस्तेमाल किया जा सकता है मनका displacements ट्रैक.
- विस्थापन परिमाण दिशा और स्थान पैरामीटर तो एक गणितीय मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है डिवाइस सतह पर तनाव क्षेत्रों विशेषताएँ.
एक समान प्रक्रिया 3D प्रणालियों में उपभेदों विशेषताएँ करने के लिए पीछा किया जा सकता है. घंटे फ्लोरोसेंट मोतियों की एक मात्रा में मिक्सydrogel अग्रदूत समाधान. खूंटी hydrogel प्रणाली के मामले में, ध्यान में लीन होना आकार 1 सुक्ष्ममापी व्यास मोती की उन लोगों की तुलना में बहुत छोटे होते हैं. मोती hydrogel में समझाया जाता है, और एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग imaged किया जा सकता है. मनका displacements तो, ट्रैक किया जा सकता है विश्लेषण और विरूपण मॉडल के लिए फिट है.
जी प्रतिनिधि परिणाम
उपकरण निर्माण, लक्षण और ऑपरेशन के लिए प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े 5 और 6 में प्रदान की जाती हैं.
चित्रा 1 सैंडविच मोल्ड निर्माण की प्रक्रिया. (ए) एक ओवरहेड पारदर्शिता को ध्यान से एक SU-8 मास्टर पर uncured PDMS पर उतारा है. (बी) सैंडविच एक फोम, कांच, धातु और ढेर में रखा गया है, और संपीड़न के तहत एक ओवन में ठीक हो. (सी) ढेर disassembled और पारदर्शिता दूर खुली, नमूनों PDMS 3 परत को बनाए रखना है . भौतिकी संस्थान की अनुमति से reproduced.
चित्रा 2 खड़ी actuated micropost की (ए) बाकी और (बी) actuated जब में योजनाबद्ध. (सी) बहुपरत निर्माण की प्रक्रिया के योजनाबद्ध 3 microposts की एक सरणी बनाने की आवश्यकता है. भौतिकी संस्थान की अनुमति के द्वारा रूपांतरित किया.
Figure 3. Microactuator सरणी को संशोधित करने के लिए एक deforming दो आयामी 7 सब्सट्रेट पर संवर्धित कोशिकाओं के लिए प्रयोगों का संचालन प्रक्रिया . रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी की अनुमति से reproduced http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
चित्रा 4 microactuator सरणी को संशोधित करने के लिए तीन आयामी photopatterned hydrogel में संवर्धित कोशिकाओं के लिए प्रयोगों का संचालन प्रक्रिया 10 constructs . Elsevier की अनुमति के द्वारा reproduced.
चित्रा 5 (ए) 2D mechanostimulatory संस्कृति के लिए नमूना डिवाइस. लाल डाई actuating दबाव वितरण चैनलों, और नीले रंग की डाई स्नेहन चैनलों निशान थे निशान थे. (बी) एक तनाव लक्षण वर्णन प्रयोग का नमूना छवि. रेड स्पॉट मोतियों के undeformed स्थान का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि हरी धब्बे विकृत स्थानों 7 का प्रतिनिधित्व करते हैं. रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी की अनुमति से reproduced http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
चित्रा 6 (ए) 3 डी compressive प्रयोगों के लिए नमूना डिवाइस . ग्रीन डाई actuation दबाव चैनलों निशान थे. (बी) (सी) पोस्ट के शीर्ष पर एक hydrogel नमूनों का निर्माण के साथ टॉप - डाउन micropost सरणी का दृश्य. (डी, ई) साइड खंगाला hydrogel में फ्लोरोसेंट मोतियों की छवियों (डी) आराम और (ई) 55 kPa actuation के दबाव के तहत निर्माण, एक 3D संस्कृति 10 प्रणाली में तनाव लक्षण वर्णन प्रक्रिया प्रदर्शन . Elsevier की अनुमति के द्वारा reproduced.
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Discussion
हालांकि, अवधारणात्मक सरल युक्ति छलरचना करता है कुछ प्रयोगात्मक कौशल और अभ्यास ले. 2D सेल संस्कृति के मामले में विशेष रूप से, डिवाइस में कई परतों के संरेखण चुनौतीपूर्ण, विशेष रूप से एक बड़े क्षेत्र सरणी पर किया जा सकता है. बोल व्यावहारिक, हम मज़बूती से एक 100% संरेखण सफलता के कई परतों में आसन्न सुविधाओं के बीच रिक्ति में 50 सुक्ष्ममापी सहिष्णुता के साथ उपकरणों का उपयोग दर हासिल कर सकते हैं. हम भी सफलतापूर्वक 15 सुक्ष्ममापी रूप में कम के रूप में tolerances के साथ संरेखण प्रदर्शन किया, लेकिन संरेखण आवश्यक समय काफी अधिक है और एक कम सफलता दर पर हासिल की. सरणी पर photopattern biomaterials के लिए मुखौटा के संरेखण इसी तरह, चुनौतीपूर्ण है, लेकिन पदों के लिए hydrogel सिलेंडरों की तुलना में काफी बड़ी हो सकती है बनाया जा सकता है, इस बाधा को समाप्त.
अन्य चुनौतियों इस प्रोटोकॉल में वर्णित सामग्री पर सेल संस्कृति शामिल है. 2D खींच प्रणाली में, PDMS का उपयोग कर के रूप में एक संस्कृति फिल्म अल्पकालिक प्रयोगों के लिए जैविक जांच की सीमा, सेल सब्सट्रेट करने के लिए आसंजन के रूप में काफी उत्तेजना के 6 घंटे के बाद प्रभावित होना शुरू होता है. यह PDMS 11 सतह के लिए, या अधिक प्रासंगिक चिकित्सकीय polyurethane सामग्री, कोशिका आसंजन में सुधार और आयोजित जैविक 12 प्रयोगों में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं के साथ PDMS सेल संस्कृति सब्सट्रेट की जगह covalently बाध्यकारी मैट्रिक्स प्रोटीन द्वारा सुधारा जा सकता है. वर्णित 3 डी प्रणाली में, hydrogel रसायन शास्त्र एक उदाहराणदर्शक उदाहरण के रूप में ही इरादा है. पक्षपाती कोशिकाओं की संस्कृति लंबी अवधि के वैकल्पिक प्राकृतिक या कृत्रिम hydrogels के उपयोग, या खूंटी मैट्रिक्स (जो आसानी से मानक PEGylation chemistries का उपयोग कर प्राप्त कर सकते हैं) 13 में चिपकने वाला ligands के शामिल किए जाने की आवश्यकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल और स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (323533-06 CHRPJ), ओंटारियो ग्रेजुएट छात्रवृत्ति कार्यक्रम मुख्यमंत्री, और माइक्रो और नैनो इंजीनियरिंग सिस्टम में कनाडा अनुसंधान अध्यक्षों से वाईएस वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं, और कैस के लिए Mechanobiology में.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit | Dow Corning | ||
| SU-8 masters | |||
| Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | United Chemical Technologies | ||
| Foam pads | Craft supply stores, 1-2 mm thick | ||
| Overhead inkjet transparencies | Grand Toy | ||
| Plexiglass plates | |||
| C-clamp | hardware store | ||
| Micromanipulator system | Siskiyou, Inc. | ||
| Custom-made vaccum mount | |||
| Vision system, Navitar 12x zoom | Navitar | ||
| Connecting tubes | VWR international | Clay Adam Intramedic PE190 | |
| Blunt 18G needles | Small Parts (www.smallparts.com) | ||
| Eccentric diaphragm micropump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | |
| Solenoid valves | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Function generator | |||
| 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | ||
| Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa | Laysan Bio Inc. | ||
| Polyethylene glycol 8 kDa | Sigma-Aldrich | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | ||
| 1-vinyl-2-pyrolidinone | Sigma-Aldrich | ||
| Standard cell culture reagents |
References
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