Summary
En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.
Abstract
La capacidad de controlar sistemáticamente en respuesta celular in vitro a combinaciones de estímulos mechanobiological para ingeniería de tejidos, el descubrimiento de fármacos o fundamentales los estudios de biología celular está limitado por las tecnologías de biorreactores actual, que no puede, simultáneamente, aplicar una variedad de estímulos mecánicos a las células cultivadas. Con el fin de abordar esta cuestión, hemos desarrollado una serie de plataformas microfabricated diseñado para detectar los efectos de los estímulos mecánicos en un formato de alto rendimiento. En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología y, además, demostrar cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en dos dimensiones y tres paradigmas de la cultura dimensional.
Protocol
A. Descripción de dispositivo y la operación
Dispositivos se fabrican utilizando la litografía blanda multicapa en un polidimetilsiloxano (PDMS), y son capaces de generar al mismo tiempo una serie de condiciones mecánicas en los distintos lugares de cultivo de células a través de la matriz microfabricated. En este protocolo, los pasos para fabricar una amplia gama de neumático accionado por microposts se describió por primera vez, seguido de pasos para modificar el dispositivo para hacer posible la cultura mecánica dinámica, tanto en la cultura paradigmas de dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D). El enfoque esbozado microfabricated aumenta el rendimiento en los sistemas de macro-escala, y es el más adecuado para la detección de los efectos de una variedad de condiciones mecánicas.
El principio de funcionamiento del dispositivo se basa en una serie de microposts vertical accionada. Microposts se fabrican en un diafragma de suspensión libre, y suben y bajan por la aplicación de presiones positivas y negativas por debajo del diafragma de accionamiento (Figura 1). Una característica clave de la matriz es que variando el tamaño de la membrana de actuación, una fuente de presión solo se puede utilizar para obtener una serie de desplazamientos verticales a través de la matriz. Este principio se utiliza para detectar rápidamente la respuesta celular a un gran número de condiciones de estimulación mecánica a través de un único dispositivo.
Basado en un diseño similar a macroescala por Schaffer et al. 2, nuestro diseño incluye una segunda película de suspenso y lubricar el cultivo de células en el cargo, permitiendo que las células de experimentar una deformación del sustrato en 2D como se desliza la cultura cinematográfica en el puesto de carga elevada. Por otra parte, photopatterning una serie de células cargadas de hidrogeles sobre los postes de carga permite la compresión para la estimulación de células en cultivo en 3D. Las instrucciones detalladas en el establecimiento de estos sistemas de seguimiento.
B. La fabricación de la matriz microactuator neumáticos
Fabricación de la matriz microactuator neumático requiere la alineación estricta de las estructuras multicapa de PDMS. Este es un reto, debido a la contracción inducida por los errores de alineación de registro. Para solucionar esto, usamos un proceso de fabricación llamado "fabricación de moldes sandwich '3, que se muestra a eliminar de manera efectiva el tema 4.
Preparación de los materiales
- Escoger o multi-nivel-SU-8 maestros para cada uno de los distintos niveles se fabrican en una sala limpia utilizando procedimientos estándar. Para estos dispositivos, los maestros son 200-400 micras de espesor, dependiendo de la aplicación. Maestros son hardbaked a 80 ° C durante tres días antes de su uso.
- Diapositivas limpiar el cristal y los maestros de SU-8 son silanizada en una cámara de vacío, para evitar la adherencia de curado PDMS a los materiales. En un fumehood, 60 l de la agente de silanización (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (Reino Tecnologías Químicas, Bristol, PA) es una pipeta en una placa de Petri en la cámara. El vidrio desnudo y SU-8 maestros se colocan en la cámara y se mantiene bajo vacío durante la noche.
- Dos almohadillas de espuma (disponible en las tiendas de artesanía) y una película de transparencia de inyección de tinta de arriba se cortan al tamaño ligeramente mayor que el maestro de SU-8 utilizados para la fabricación de moldes sándwich.
Sandwich fabricación de moldes
- Cada capa del dispositivo multicapa requiere una capa de PDMS moldeado con este método. Un diagrama esquemático del proceso de fabricación de moldes sándwich se presenta en la Figura 1.
- PDMS monómero entrecruzante y se mezclan en el estándar de 10:1. 3 ml de mezcla curado PDMS se depositan en un previamente fabricado SU-8 amo, y desgasificado en una cámara de vacío.
- La almohadilla de espuma y SU-8 maestros se colocan en una placa base de plexiglás.
- La transparencia es cuidadosamente baja en el curado PDMS, asegurándose de evitar atrapar burbujas de aire. Transparencias para inyección de tinta tiene un duro y un lado liso, y es importante que los contactos cara lisa del curado PDMS.
- Una lámina de vidrio silanizada se coloca en la parte superior de la transparencia, por debajo de la almohadilla de espuma segundo y una placa de plexiglás superior. El sándwich se fijan entonces en conjunto con un C-clamp.
- El sándwich de PDMS se cura en un horno a 80 ° C durante al menos 4 horas.
- El sándwich se retira del horno y deja enfriar antes de retirar la pinza.
- La pinza se retira y se desmonta el bocadillo, y las almohadillas de espuma se descartan. La transparencia es cuidadosamente despega de la SU-8 master, conservando la película con dibujos PDMS.
- Estas capas de dibujos PDMS y sus capas de la transparencia de manejo se pueden almacenar en un ambiente libre de polvo hasta que estén listos para su uso. Hemos utilizado con éxito capas PDMS hasta dos meses de edad, sin efectos nocivos notables.
La construcción del dispositivo multicapa
t "> El esquema para la fabricación de la matriz microactuator se presenta en la Figura 2A, y el funcionamiento de los actuadores se muestra en las figuras 2B y C. Para fabricar el dispositivo:- La más baja patrón PDMS capa se prepara la fabricación del molde sándwich. Para estos experimentos, con movimientos circulares que van desde 600 a 1200μm de diámetro se utilizaron.
- La capa de PDMS se transfiere a un portaobjetos de vidrio limpio. Una unidad de descarga de corona se usa para tratar el PDMS y vidrio superficies con plasma de oxígeno, y las dos superficies se ponen en contacto unos con otros. La pila se coloca sobre una placa calefactora a 80 ° C para completar el proceso de unión. La transparencia puede ser desprendido y se desecha. Durante este proceso, la película de dibujos PDMS no se libera a partir de un sustrato rígido, la prevención de la contracción de las capas individuales.
- Dependiendo del éxito de la etapa de moldeo sándwich, películas delgadas de PDMS que no han sido expulsados de entre el SU-8 funciones y la transparencia posible que tenga que ser removido. Esto se puede hacer de forma manual utilizando una aguja 25G en un estereoscopio.
- La capa de sándwich segundo moldeado se forma como un molde negativo de la réplica deseada diafragma-y post-estructura. Esto se debe a la fabricación de grandes superficies SU-8 maestros es un reto, pero el uso de procesos de fabricación alternativa podría eliminar este paso extra. En esta demostración, los mensajes circular 500 micras de diámetro se utilizaron. El molde negativo se replica silanizada, y temporalmente colocada en un portaobjetos de vidrio con cinta de doble cara. No curado PDMS se deposita, desgasificado y spin-revestido sobre esta capa de molde sándwich durante 45 segundos a 1000 rpm, produciendo un diafragma de accionamiento 60 micras de espesor. El spin-revestido de capa PDMS es parcialmente curado a 80 ° C durante unos 20 minutos, o hasta que el PDMS es pegajoso, pero no se deforman permanentemente cuando se toca.
- La lámina de vidrio y cinta de doble cara se eliminan de la parte de curado capa de PDMS, que luego se plasma tratados, invertida y colocada en un alineador de la medida. El alineador se compone de un plato vacío montados en un micromanipulador (Siskiyou; Misión Viego, CA, EE.UU.). La primera capa de PDMS es el plasma tratado y se coloca en un escenario giratorio (Newmark, de Grants Pass, Oregón, EE.UU.), bajo el plato vacío, y la alineación entre las dos capas se observa con un zoom de 12x Navitar máquina de sistema de visión (Navitar; Rochester, NY, EE.UU.).
- Las capas se alinean con el manipulador y el cuidado puesto en contacto. El sándwich se retira del alineador, y se cura en un horno a 80 ° C durante 30 minutos. La transparencia y la réplica de PDMS silanizada molde puede ser pelado desde el dispositivo y se desecha. El dispositivo está completamente curada luego a 80 ° C durante al menos cuatro horas.
- Dependiendo del tipo de experimento de estimulación mecánica está llevando a cabo, capas adicionales PDMS puede estar unido a este dispositivo de base de repetir el proceso descrito. Detalles de los distintos tipos de experimentos de estimulación mecánica se proporcionan en las secciones C y D.
Conectores
- Una vez que el dispositivo se ha completado, una aguja se puede utilizar para eliminar la capa de PDMS en el punto de conexión.
- Conectores comerciales tales como la NanoPort (Upchurch Científico, Oak Harbor, WA, EE.UU.) se puede utilizar para interactuar con tubos externos. Para evitar los requisitos de altura de los conectores comerciales, y por lo tanto el uso estándar de placas de Petri como contenedores de dispositivos, fabricamos nuestros propios de la siguiente manera.
- Aproximadamente 35 g de PDMS se proyecta y se cura en una bandeja de omni-pocillos (Nunc, Rochester, NY, EE.UU.). El dispositivo está pelada y cortada en secciones pequeñas juntas, de los cuales un 1 / 8 "agujero se retira con un punzón.
- Una aguja 18G embotado se utiliza para una sección central de la parte de la junta. Una aguja más pequeña 21G se utiliza para eliminar el núcleo central antes de retirar la aguja 18G.
- Aproximadamente 15 g de PDMS se echa y se curan en una tapa de la bandeja omni-así, peladas y cortadas en la sección de tamaño similar. En esta sección se limpia con cinta adhesiva, de plasma unida a la parte superior de la junta, y la unidad se plasma en condiciones de servidumbre en el dispositivo, lado perforado hacia abajo.
- Una segunda aguja 18G roma se separa de la pieza de plástico de color luer, inserta en el agujero sin corazón y sellada en el lugar con unas gotas de PDMS. El conector resultante es bastante eficaz, económico y tiene un volumen de espacio muerto lo suficientemente grande como para evitar burbujas de aire en los canales durante las etapas de llenado de líquido.
C. mecánicamente activa substratos de cultivo 2D
El conjunto de microposts accionada se puede utilizar para crear varios perfiles de tensión en una suspensión película de polímero, en el que las células son cultivadas. Elevar el poste en una película de lubricación hace que la película se deslice y se deforman alrededor del poste. El uso de un resultado de carga circular después de una distribución de tensiones equibiaxial, pero elel diseño es muy versátil en formas que después se pueden utilizar diferentes para crear una variedad de campos de deformación. Para modificar la matriz del actuador para los experimentos de la cultura en 2D (esquema de la Figura 3):
- Unir una tercera capa de PDMS en el dispositivo, como se muestra en la Figura 3a. La tercera capa de PDMS se compone de una estructura de dos capas. El círculo inferior coincida con el tamaño de la cavidad de actuación por debajo de la microposts accionada. El diámetro del círculo superior es 100μm mayor que el diámetro de los puestos de carga. A 200 m de ancho microcanal conecta estas características a una zona de conexión, y se usa para lubricar los puestos de carga y la cultura cinematográfica.
- Fabricar y conectores de enlace en el dispositivo, como se describió anteriormente.
- Girar una capa de 10 a 15 micras de espesor de capa de PDMS sobre el lado suave de una transparencia (los parámetros de giro: 4000 RPM, 120 segundos). Cura a 80 ° C durante al menos 4 horas.
- Appy un vacío de bajo nivel (Cadet Barnant bomba de aspiración de aire) para los actuadores, la reducción de la variedad de mensajes.
- Plasma tratar y de bonos de la película de vuelta a la cubierta PDMS microdispositivo accionada. Colocar sobre una placa calefactora a 80 ° C durante 10 minutos. Los postes y el cine la cultura seguirá siendo hidrofílico por un corto tiempo.
- Llenan los canales de lubricación con un 90% de glicerol en una solución de agua destilada. Además de la lubricación, esta formulación mantiene la hidrofilia del PDMS de forma indefinida, la reducción de los coeficientes de fricción. Burbujas de aire quedan atrapadas entre el poste y la cultura cinematográfica. Coloque el dispositivo sobre una placa calefactora a 40 ° C, y seguir inyectando lubricante en el canal, provocando un aumento de presión pequeños. Después de unos minutos, las burbujas de aire se difunden a través de la PDMS, y todas las superficies lubricadas ser.
- Eliminar la presión negativa, la liberación de los postes.
- El uso de un bisturí, corte alrededor de la delgada película de PDMS. Retire con cuidado la transparencia retrocediendo desde el dispositivo.
- Plasma un bono cortadas a mano PDMS junta de todo el área de cultura del dispositivo.
- Esterilizar el dispositivo por inmersión en etanol al 70% durante 5 minutos, y luego bajo una luz ultravioleta germicida en una cabina de seguridad biológica durante 45 minutos.
- Plasma el tratamiento de la superficie e incubar con 100 mg / ml de colágeno (proteína o alternativa ECM) durante la noche a 4 ° C.
- Lave el dispositivo con tampón fosfato salino (PBS), y las células de las semillas a 10-15000 células / cm 2, a raíz de los protocolos estándar de cultivo celular.
Caracterización detallada de la operación microdispositivo y experimentos biológicos realizados en esta plataforma han sido publicados en otros lugares 7.
D. mecánicamente activas 3D hidrogeles
Modificaciones en el dispositivo también se puede utilizar para habilitar la compresión de photopatterned. celular con carga, en tres dimensiones hidrogeles en forma de alto rendimiento. En este ejemplo, creamos 350 micras de diámetro de polietileno glicol (PEG) cilindros de hidrogel, encapsulando C3H10T1 / 2 células madre mesenquimales del ratón, y se aplican tensiones de compresión que van desde 5 a 25% a través de la matriz. Este protocolo se puede utilizar con más química avanzada de hidrogel de fotopolimerización. Para utilizar la plataforma para realizar experimentos en tres dimensiones mecanobiología (esquema de la Figura 4):
Modificaciones del dispositivo:
- Escudo de los puestos con una capa gruesa de 1 m Parileno-C para reducir la permeabilidad a los gases y mejorar los tiempos de polimerización en el sistema de hidrogel de PEG. Esto reducirá los efectos citotóxicos de la reacción de fotopolimerización de los radicales libres basada en. Pedazos de cinta adhesiva se utilizan para enmascarar las áreas alrededor del poste, y el dispositivo está recubierto de un PDS 2010 LabCoter 2 del sistema (Especialidad en sistemas de revestimiento, Indianapolis, IN, EE.UU.).
- El dispositivo de recubrimiento se elimina del sistema de revestimiento, y la cinta adhesiva desprendido, dejando una capa de conformación de Parileno-C en los puestos de trabajo.
- Un cubreobjetos es methacrylated 8 por inmersión en un 2% v / v de 3 - (trimetoxisilil) metacrilato de propilo en etanol al 95% durante 2 minutos.
- El cubreobjetos se aclara en el 100% de etanol, y se hornea a 100 ° C, dejando a los grupos de metacrilato en la superficie.
- A 200 m de espesor película espaciadora PDMS se echa en una placa de Petri, y se corta en pequeñas secciones. Cuatro de estas pequeñas secciones se plasma en condiciones de servidumbre en todo el borde del cubreobjetos methacrylated.
- Los espaciadores son el plasma unido a la PDMS zonas del dispositivo, que cubren los postes C Parileno recubiertos.
- El dispositivo está esterilizado por el lavado en etanol al 70%, y la exposición a la luz UV germicida en una cabina de seguridad biológica durante 45 minutos.
Polimerización in situ:
Células cargadas de hidrogeles de PEG eran entonces photolithographically patrón en el 8,9 dispositivos de la siguiente manera:
- Prepare un 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio, árabe, AL, EE.UU.) y el 10% w / v de PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)solución en unsupplmented medios de cultivo celular.
- Preparar una solución de fotoiniciador de 100 mg / mL de Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, EE.UU.), 1-vinil-2-pyrolidinone.
- Mezclar bien las dos soluciones preparadas en conjunto para obtener una solución con una concentración de 0,4% w / v de fotoiniciador. Filtrar la mezcla a través de un filtro de 0,45 micras jeringa para esterilizar y eliminar las partículas.
- Trypsinize cultivos celulares y preparar una suspensión celular en medio de cultivo, el doble de la concentración deseada de células de punto final.
- Mezcle la suspensión de células y la solución de hidrogel filtrada precursor / fotoiniciador en una proporción de 1:1.
- Se inyecta la solución en el microdispositivo utilizando una aguja 25G de largo. Con cuidado, evitar que queden atrapadas burbujas en el dispositivo.
- Alinear una máscara de transparencia impresa a las marcas de alineación en la superficie del dispositivo. Establecer un sistema de iluminación UV para proporcionar una dosis UV de 17,5 mW / cm 2 en la superficie del dispositivo. Iluminar el hidrogel a través de la máscara de 195 s. Esta vez ha sido optimizado para nuestro sistema, y puede ser necesario ajustar.
- Lavar solución polimerizado precursor de hidrogel con PBS, y sustituir la PBS con medios de cultivo. Accionar la carga de los mensajes para comprimir las construcciones de hidrogel.
Caracterización detallada de la operación microdispositivo y experimentos biológicos realizados en esta plataforma han sido publicados en otros lugares 10.
E. equipo periférico
Modificado placas de Petri se utilizan para mantener la esterilidad de los cultivos celulares durante el accionamiento de los dispositivos. Una aguja roma y despojado 18G es pegado con resina en un agujero perforado en el lado de la placa de Petri. Tubos (Clay Adams Intramedic PE190, VWR International, Arlington Heights, IL, EE.UU.), está montado a presión a estos conectores y se conecta a las válvulas de solenoide y fuente de presión.
Las presiones para que los dispositivos son proporcionados por microbombas externo. Para los experimentos de 2D, los valores de presión positiva de 30 a 55 kPa se generaron utilizando una bomba de diafragma controlado por tensión excéntrica (SP 500 EC-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Alemania). Un controlador de modulación por ancho de pulso de tensión basado se utiliza para variar la tensión aplicada al control de la presión de salida. Las válvulas de solenoide y colectores (S10MM-30-12-3 y un MSV10; Pneumadyne, Plymouth, MN, EE.UU.) se utilizan para crear una onda de presión cíclica. Las válvulas se accionan con una señal de 12 V, controlado por un generador de forma de onda de la función cuadrado.
F. caracterización de dispositivos y utilice
Imágenes en el dispositivo
Un problema común con las células de imagen o de partículas en el dispositivo es una pobre resolución óptica debida a la condensación de las gotas debajo de la película PDMS apoyar el mensaje de carga. Esta condensación se debe a las diferencias de temperatura y humedad dentro de la incubadora y después de la fijación o en una platina del microscopio. Para resolver este problema:
- Conecte un depósito abierto en el puerto de entrada de presión, y llenarlo con agua destilada. Nosotros usamos una jeringa de abrir con un conector de cierre luer para mayor comodidad.
- Coloque el dispositivo y el depósito lleno en una cámara de vacío, y la bomba hacia abajo.
- Espere 5 minutos, y llevar la cámara a la presión atmosférica. Repetir dos o tres veces. Cuando el aire se desplaza fuera de los canales del dispositivo, es reemplazada por agua desde el embalse, la eliminación de los condensados de gota y proporcionar un camino claro para microscopía óptica.
- Áreas de cultura de la imagen utilizando el campo brillante o microscopía de fluorescencia.
De imágenes de células vivas, este procedimiento se puede realizar antes de la siembra de las células en los dispositivos. Sin embargo, los canales deben diseñarse lo suficientemente grande como para evitar cualquier pérdida de presión viscosa entre las unidades en el dispositivo.
Caracterización de las cepas mediante el seguimiento de cuentas
En los sistemas de cultivo en 2D:
- Diluir 1 m de diámetro perlas fluorescentes (Bangs Laboratorios; Fisher, IN) en metanol hasta la concentración deseada. Diluciones de 1:150 a partir de las concentraciones original (sólidos del 1% en solución tampón de cuentas) se encontró que ser adecuado para nuestras necesidades.
- Plasma el tratamiento de la superficie del dispositivo, y el depósito l 10.5 de la suspensión de cuentas.
- Espere a que el metanol se evapore. Repetir si la concentración de grano es muy bajo.
- Imagen de la celda de áreas de cultivo en reposo y bajo carga.
- De código abierto algoritmos automatizados de rastreo de partículas puede ser utilizado en ImageJ (NIH) para seguir los desplazamientos de cuentas.
- Los parámetros de la magnitud del desplazamiento, dirección y ubicación se puede utilizar en un modelo matemático para caracterizar los campos de tensión en la superficie del dispositivo.
Un procedimiento similar puede seguirse para caracterizar las cepas en los sistemas de 3D. Mezcle una cantidad de perlas fluorescentes en el hydrogel solución precursora. En el caso del sistema de hidrogel de PEG, el tamaño de los poros son mucho menores que las de los 1 m de diámetro cuentas. Los granos son encapsulados en el hidrogel, y el sistema se pueden obtener imágenes con un microscopio confocal. Desplazamientos de bolas puede ser seguido, analizado y montado en un modelo de deformación.
G. Representante Resultados
Los resultados representativos para la fabricación del dispositivo, la caracterización y funcionamiento se proporcionan en las figuras 5 y 6.
Figura 1. Molde Sandwich proceso de fabricación. (A) una transparencia es cuidadosamente bajó a curar PDMS en un SU-8 maestro. (B) El sándwich se coloca en una pila de espuma, vidrio y metal, y se cura en un horno a la compresión. (C) La pila está desmontada y la transparencia desprendido, conservando el patrón PDMS capa 3. Reproducido con permiso del Instituto de Física.
Figura 2. Esquema de micropost vertical accionada a (A) de descanso y (B) cuando se acciona. (C) Esquema del proceso de fabricación de múltiples capas para crear una matriz de microposts 3. Adaptado con el permiso del Instituto de Física.
Figura 3. Proceso de modificar serie microactuator llevar a cabo experimentos de cultivos de células en una deformación de dos dimensiones sustrato 7. Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
Figura 4. Proceso de modificar serie microactuator llevar a cabo experimentos de cultivos de células en tres dimensiones de hidrogel photopatterned construye 10. Reproducido con permiso de Elsevier.
Figura 5. (A) dispositivo de muestra para cultivo mechanostimulatory 2D. Colorante rojo usado para marcar los canales de presión de accionamiento de entrega, y el tinte azul que se utiliza para marcar los canales de lubricación. (B) muestra la imagen de un experimento de la caracterización de cepas. Puntos rojos representan la ubicación no deformada de las cuentas, mientras que los puntos verdes representan los lugares deforme 7. Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
Figura 6. (A) del dispositivo de muestra para experimentos en 3D a la compresión. Colorante verde para marcar los canales de accionamiento de presión. (B) de arriba a abajo de la matriz de micropost con (C) la construcción de un hidrogel con dibujos en la parte superior del poste. (D, E) lateral reconstruido imágenes de perlas fluorescentes en el hidrogel construir bajo (D) y el resto (E) 55 kPa presiones de actuación, lo que demuestra el proceso de caracterización de la cepa en un sistema de cultivo en 3D 10. Reproducido con permiso de Elsevier.
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Discussion
Aunque conceptualmente simple, la fabricación del dispositivo tiene una cierta habilidad y la práctica experimental. Particularmente en el caso del cultivo de células en 2D, la alineación de las múltiples capas en el dispositivo puede ser un reto, sobre todo en un conjunto de gran superficie. En términos prácticos, de manera fiable puede lograr una tasa de éxito del 100% de alineación uso de dispositivos con 50 micras de tolerancia en el espaciado entre elementos adyacentes en múltiples capas. También se ha demostrado con éxito la alineación con tolerancias tan bajas como 15 micras, pero la alineación de tiempo requerido es mucho mayor y se consigue a una tasa de éxito menor. Alineación de la máscara a los biomateriales photopattern en la matriz es igualmente difícil, pero los mensajes pueden ser diseñados para ser muy grande en comparación con los cilindros de hidrogel, el alivio de esta restricción.
Otros desafíos incluyen el cultivo de células de los materiales descritos en este protocolo. En el sistema 2D de estiramiento, con PDMS como una película de la cultura límites de la investigación biológica de experimentos a corto plazo, como la adhesión celular al sustrato comienza a verse seriamente afectados después de 6 horas de estimulación. Esto puede ser rectificada por covalentemente proteínas de la matriz de unión a la superficie de PDMS 11, o mediante la sustitución de la célula PDMS sustrato de cultivo con un material de poliuretano más clínicamente relevantes, para mejorar la adhesión celular y una mayor flexibilidad en los experimentos biológicos realizados 12. En el sistema descrito en 3D, la química de hidrogel se concibe como un ejemplo ilustrativo. A largo plazo el cultivo de células adherentes requiere el uso de hidrogeles alternativa natural o sintético, o la inclusión de ligandos de adherencia a la matriz de PEG (que se puede lograr fácilmente con la química estándar PEGilación) 13.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo financiero de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CHRPJ 323533-06), el programa de Becas de Posgrado Ontario a CM, y los presidentes de Investigación en Micro y Nano Sistemas de Ingeniería de YS, y en Mecanobiología al CAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit | Dow Corning | ||
| SU-8 masters | |||
| Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | United Chemical Technologies | ||
| Foam pads | Craft supply stores, 1-2 mm thick | ||
| Overhead inkjet transparencies | Grand Toy | ||
| Plexiglass plates | |||
| C-clamp | hardware store | ||
| Micromanipulator system | Siskiyou, Inc. | ||
| Custom-made vaccum mount | |||
| Vision system, Navitar 12x zoom | Navitar | ||
| Connecting tubes | VWR international | Clay Adam Intramedic PE190 | |
| Blunt 18G needles | Small Parts (www.smallparts.com) | ||
| Eccentric diaphragm micropump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | |
| Solenoid valves | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Function generator | |||
| 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | ||
| Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa | Laysan Bio Inc. | ||
| Polyethylene glycol 8 kDa | Sigma-Aldrich | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | ||
| 1-vinyl-2-pyrolidinone | Sigma-Aldrich | ||
| Standard cell culture reagents |
References
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