Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Einzelheiten des Verfahrens zur Kryokonservierung humanen iPS-Zellen in KnockOut SR Kryokonservierungsmedium und Gewinnung dieser Zellen in völliger KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) mittel-oder Feeder-basierte KnockOut SR Medium.
Abstract
Die Entdeckung im Jahr 2006, dass Mensch und Maus-Fibroblasten umprogrammiert könnte zu iPS-Zellen 1-3 mit Qualitäten bemerkenswert ähnlich wie embryonale Stammzellen zu erzeugen ist eine wertvolle neue Quelle für pluripotente Zellen für die Wirkstoffforschung, Zell-Therapie und Grundlagenforschung geschaffen.
GIBCO Medien und Reagenzien sind an der Spitze der pluripotenten Stammzellen seit Jahren. Knockout DMEM mit Knockout Serum Replacement ergänzt wird das Medium der Wahl für die embryonalen Stammzellen das Wachstum und nun iPS Zellkultur 3-9. Dieser Goldstandard Medien kann nun für Feeder-freien Kultur mit der Zugabe von Knockout SR Growth Factor Cocktail verwendet werden.
Traditionelle menschliche ES-und iPS-Zellkultur-Methoden erfordern den Einsatz von Maus oder humanen Fibroblasten Feederschichten oder Feeder-konditioniertem Medium. Diese Kultur Methoden sind arbeitsintensiv, hart zu skalieren und es ist schwierig, Hüften Zellen undifferenziert wegen der undefinierten Zustand zu erhalten. Invitrogen hat Knockout SR Growth Factor Cocktail entwickelt, damit Sie auf einfache Weise Übergang Hüfte und hES-Zell-Kulturen zu Feeder-free unter Beibehaltung Ihrer Benutzung der Knockout SR.
Protocol
Hinweis: Um sterile Kultur Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden alle Verfahren in diesem Protokoll unter Verwendung von sterilen Laborpraxis durchgeführt und führte unter einer Laminar-Flow-Haube.
Vor dem Start, sicherzustellen, dass alle Medien äquilibriert bis 37 ° C und entsprechend vergast.
Vorbereitung Geltrex-beschichteten Kulturschalen
Hinweis: siehe Anhang für die Nutzung von CELLstart beschichteten Kulturschalen.
- Thaw eine Tube Geltrex (1 mL) langsam bei 2-8 ° C und verdünnt 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Mischen Sie die Lösung vorsichtig.
Hinweis: Einige iPS-Zelllinien kann eine andere Geltrex Verdünnung für ein optimales Wachstum benötigen. Siehe Anhang für alternative Verdünnungen. - Abdeckung der gesamten Oberfläche jeder Kulturschale mit dem Geltrex-Lösung (1 mL für eine 35-mm-Schale, 1,5 mL für eine 60-mm-Schale).
- Seal jedes Gericht mit Parafilm zum Trocknen zu verhindern und inkubieren Sie die Gerichte für 1 Stunde bei 37 ° C.
Hinweis: An dieser Stelle können Sie die Geltrex-beschichteten Kulturschalen bei 4 ° C lagern bis zu 1 Monat. Seal jedes Gericht mit Parafilm die Geltrex vor dem Austrocknen zu verhindern. - Vor dem Einsatz, übertragen Sie die Geltrex-beschichtete Platten zu einem Laminarströmungshaube und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) ausgleichen.
Vorbereitung Komplette KnockOut SR Feeder-freiem Medium
- Zur Vorbereitung 1 mL von 10 pg / mL Grundlegende FGF-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zu 6 Monaten.
Grundlegende FGF 10 ug D-PBS 990μL 10% BSA 10 l
Hinweis: BSA mit HSA oder Knockout SR in der gleichen Konzentration ersetzt werden. - Zur Vorbereitung 50 ml 2 mg / mL Dispase-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren der Lösung und lagern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
Dispase 100 mg D-PBS 50 mL - Zur Herstellung von 100 ml komplette KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) aseptisch verbinden die Komponenten in der Tabelle unten aufgeführt.
Komponente Lager-Konzentration Endkonzentration Volumen Knockout DMEM/F12 (Kat.-Nr. 12660-012) - 1X 76,8 mL Glutamax-I (Kat. Nr. 35050-061) 200 mM 2 mM 1 mL KnockOut SR (Kat.-Nr. 10828-028) - 20% 20 mL KnockOut SR-GFC (Kat.-Nr. A10580-01) 50X 1X 2 mL bFGF (Kat.-Nr. PHG0024). 10 ug / mL 20 ng / mL 200 ul
Sie können die KSR-FF Medium bei 2-8 ° C lagern bis zu einer Woche. - Kurz vor pre-Gleichgewicht der gesamten mittel-bis Temperatur und Gase, aseptisch fügen Sie die erforderlichen Volumen von 2 Mercaptoethanol (55 mM Lager-Konzentration) für eine 0,1 mM Endkonzentration. Um zum Beispiel die Zubereitung von 100 ml KSR-FF medium 182 ul 55 mM 2-Mercaptoethanol (1:550 Verdünnung) Alternativ kann die 2-Mercaptoethanol zum 1X fertig zugesetzt werden und bei 2-8 ° C bis zu einer Woche.
Vorbereitung Freezing / Kryokonservierungsmedium
Die Kryokonservierung Medium besteht aus zwei Medien; Freezing Medium A und Einfriermedium B. Sie sind, um die Zellen zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen und müssen getrennt bleiben. Sie sind jeweils 50% des Gesamtvolumens der Kryokonservierung Medium benötigt. Das Gesamtvolumen der Kryokonservierung Medium benötigt wird 1 ml pro Fläschchen eingefroren werden. A 90% konfluent 60mm Teller hESC kann zu Bank 2 Fläschchen hESC in Kryokonservierung Medien eingesetzt werden.
Bereiten Sie genügend Volumen von jeweils Freezing Medium mit einer zusätzlichen 2-5ml bis overage zu gewährleisten.
| Freezing Medium A (50% Endvolumen): | 50% DMEM/F12 | 50% KSR |
| Freezing Medium B (50% Endvolumen): | 80% DMEM/F12 | 20% DMSO |
Beispiel:
Wenn Sie das Einfrieren 20 Ampullen von Zellen sind, müssen Sie 20 mL der Kryokonservierung Medium. Add 4mL für overage für eine Gesamtmenge von 24ml Kryokonservierung Medium. Das heißt, Sie müssen 12ml von Freezing Medium A (50% 24ml) und 12ml der Freezing Medium B (50% 24ml).
| Freezing Medium A (12 ml): | 6 mL DMEM/F12 | 6 mL KSR |
| Freezing Medium B (12 ml): | 9,6 ml DMEM/F12 | 2,4 ml DMSO |
Die endgültige Zusammensetzung der Kryokonservierung Medium beträgt 65% DMEM/F12, 25% KSR, und 10% DMSO.
Kryokonservierung IPSCs
- Pre-warm das erforderliche Volumen der Dispase in einem 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich.
- Pre-Gleichgewicht das erforderliche Volumen des KSR-FF in einem 37 ° C Wasserbad for15 min. Siehe Tabelle 1below für Details auf den Datenträgern erforderlich.
- Saugen Sie das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß mit einer Pipette, und spülen Sie die Zellen zweimal mit D-PBS.
- Vorsichtig fügen vorgewärmten Dispase-Lösung, um die Kultur Gefäß (z. B. 1 ml Dispase-Lösung pro 60-mm Kulturschale). Swirl das Kulturgefäß zu beschichten die gesamte Zelloberfläche.
- Inkubieren Sie die Behälter bei 37 ° C für 3 Minuten.
- Entfernen Sie das Gefäß aus dem Inkubator, absaugen Dispase-Lösung und vorsichtig waschen der Zellen mit D-PBS.
- Vorsichtig kratzen die Zellen von der Oberfläche der Kulturschale mit einem Zellschaber, und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Spülen Sie die Kulturschale zweimal mit KSR-FF, sanft "Abspritzen" alle Zellen, die nicht getrennt haben. Pool der Spül-Medium mit den Zellen in der 15 ml Tube.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren.
- Vorsichtig absaugen der Überstand ohne die Zellpellet und entsorgen Sie sie.
- Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Kryoröhrchen. Sobald die Zellen in Kontakt mit DMSO sind, sollten sie aliquotiert und eingefroren werden innerhalb von 2-3 Minuten.
- Gently Flick das Rohr voll zu verdrängen das Zellpellet aus dem Rohrboden und wieder die Zellen in Einfriermedium A. [durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 5-ml-serologischen Pipette]. Nach gleichmäßige Suspension von Klumpen, fügen gleichen Volumen Einfriermedium B, um es in einem tropfenweise Weise, unter leichtem Schwenken der Zellsuspension zu mischen.
Hinweis: An dieser Stelle werden die Zellen in Kontakt mit DMSO, und die Arbeit muss effizient durchgeführt werden. Sobald Zellen in Kontakt mit DMSO sind, sollten sie aliquotiert und eingefroren werden innerhalb von 2-3 Minuten. - Aliquot von 1 ml der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen.
- Raschen Platzierung der Röhrchen in einem Mr. Frosty [schnell einfrieren] und überträgt es auf -80 ° C über Nacht.
- Nach Lagerung über Nacht bei -80 ° C, übertragen Sie die Zellen, um eine flüssige Stickstoff-Tank für die langfristige Lagerung.
iPSC Fläschchen auftauen und die Erholung der Zellen
Hinweis: KSR-FF kann mit KSR-haltigen MEF-konditioniertem Medium oder KSR Medium für den Einsatz mit Zubringern ersetzt werden. Siehe Anhang finden Sie Anweisungen für die mediale Aufbereitung.
Pre-warmen 10 mL KSR-FF-Medium in einem 50 ml Tube.
- Äquilibrieren der entsprechenden Menge Geltrex-beschichtete Platten auf Raumtemperatur und saugen jede Flüssigkeit aus der Gerichte nur vor dem Plattieren Sier-Zellen.
- Entfernen Sie vorsichtig die hESC (oder IPSC) Fläschchen aus flüssigem Stickstoff Storage Tank.
- Schnell Tauwetter gefrorenen Fläschchen von Zellen in einer 37 ° C Wasserbad, bis nur ein kleiner gefrorener Klumpen bleibt in der Flasche.
- Spray Flasche mit 70% Isopropanol zu dekontaminieren und überträgt es auf die sterile Gewebekulturen Kapuze.
- Überführen Sie den gesamten Inhalt des Fläschchens in einen 15 mL konischen Rohr mit einer 5-ml-Pipette.
- Spülen Sie die Flasche mit 1 mL der KSR-FF und stell 'das zu den 15 mL Zentrifugenröhrchen.
- Langsam, 4 ml KSR-FF, um Zellen in der 15 ml konischen Rohr tropfenweise. Beim Hinzufügen des Mediums, sanft bewegen Sie den Schlauch hin und her, um die Zellen zu mischen. (Dies reduziert osmotischen Schock der Zellen).
- Zentrifugieren Sie die 15 ml Tube mit der Zellsuspension bei 1000rpm (200 x g) für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
- Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet.
- Re-suspend das Zellpellet in vorgewärmten KSR-FF (zB 4mL/60 mm-Schale) mit einer 5-ml-Pipette und sanft Pipette die Zellen auf und ab, bis Zellpellet vollständig dispergiert ist. Ein Lebensfähigkeit von mehr als 70% zu erwarten ist, wenn die Lebensfähigkeit von weniger als 70%, kann es länger dauern, bis die Zellen bis zur Konfluenz zu erreichen.
- Mit der gleichen Pipette die Zellsuspension auf Geltrex-beschichtete Kulturschale voräquilibriert auf Raumtemperatur tropfenweise.
- Legen Sie die Kulturschale in einem 37 ° C Inkubator mit einer angefeuchteten Atmosphäre von 4 bis 6% CO 2 in Luft. Vorsichtig schwenken Schiff in einem von Norden nach Süden, von Osten nach Westen Muster zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen.
- Gently Fluid-Änderung der Kulturschale 24 Stunden nach dem Auftauen und danach täglich um Zelltrümmer zu entfernen und an die frische Nährstoffe liefern, bis das Gericht ist etwa 70-80% konfluent. Für die weitere Kultur und Passagierung der iPS-Zellen, zu unserem Protokoll mit dem Titel "Feeder-Free Culture und Passagieren der menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium" beziehen
Erwartete Ergebnisse
Die Zellen sollten in etwa 70-80% konfluent vor Kryokonservierung werden. Dispase Verdauung Ergebnisse in Einrollen und Falzen der Kolonien entlang der Kolonie Margen. Nach der Ernte der Zellen werden sie als kleine Klumpen im Kryokonservierung Medien eingefroren. Sobald die Flasche wird aufgetaut, wieder Zellen und heften sich an die vorbeschichteten Gericht als kleine Klumpen. Sie wachsen schnell, was zu einer konfluenten Schale in 5-6 Tagen.
Tabelle 1 - Empfohlene Volumes
| Komponente | 35mm Dish | 60mm Dish | 100mm Dish |
| Komplette KnockOut SR Medium | 2 mL | 4 mL | 10 mL |
| Geltrex Lösung | 1 mL | 1,5 ml | 4-5 ml |
| Dispase | 0,5 ml | 1 mL | 3-4 mL |
| D-PBS für das Spülen | 2 mL | 4 mL | 10 mL |
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
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- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
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