Summary
Chez les insectes, les oenocytes produire des composés d'hydrocarbures cuticulaires. Ces composés se protéger contre le dessèchement et faciliter la communication chimique. Ici nous démontrons une technique de dissection utilisée pour isoler les oenocytes de l'adulte
Abstract
Dans
Protocol
Partie 1. Filet de préparation de l'abdomen adulte chez la drosophile.
La procédure décrite ci-dessous immédiate prépare l'abdomen pour l'élimination ultérieure de l'oenocytes (voir Part2 du protocole). La même procédure peut également être utilisé pour la préparation des autres tissus attachés à la surface interne de la cuticule, y compris le vaisseau dorsal (coeur par exemple) et de graisse corporelle.
Notez que dans l'article la vidéo de la technique de dissection oenocyte est démontrée sur un adulte de type sauvage (Canton-S) mouche mâle, six jours d'âge. Techniques identiques peuvent être utilisés pour enlever les oenocytes des mouches femelles. La préparation de filet de l'abdomen prend environ 5 minutes à effectuer.
Avant de commencer il est important d'avoir sous la main plusieurs épingles de dissection fine (voir ci-dessous et partie 2) et une aiguille de dissection (voir partie 2). Broches de dissection disponibles dans le commerce et les aiguilles sont souvent trop grands pour ce protocole, nous avons pris à la fabrication de notre propre laboratoire. Pour créer l'aiguille de dissection fil de tungstène, (0,005 ") est d'abord enfilé à travers l'arbre de l'aiguille hypodermique (27G, moyeu aluminium). Enfiler le fil à travers la pointe de l'aiguille hypodermique afin qu'elle émerge du moyeu. Sertir le fil en saillie du moyeu;. ce qui empêche le fil d'être tiré hors de l'aiguille hypodermique Ensuite, couper le fil à l'extrémité opposée de l'exemple de sertissage que plusieurs millimètres (~ 3-4mm) de fil de saillie de la pointe de l'aiguille hypodermique Passant. la pointe de tungstène exposés à travers une flamme va aiguiser le fil d'une pointe très fine. Une pipette jetables en plastique quand 5ml coincé dans le moyeu de l'aiguille hypodermique agit comme poignée pratique pour cet outil de dissection. Les broches de dissection fines sont faites dans un même chemin. Après l'étape de l'affûtage, saisissez la pointe du fil fermement avec une pince pour l'empêcher de bouger et de faire une coupe d'environ 3mm de la pointe pour libérer la goupille de dissection petits. Utilisez soin d'éviter d'être jeté broches de l'emprise du la pince.
Pour préparer les filets de l'abdomen adulte drosophile:
- Fixez la volée à la plaque de dissection (Sylgard; Dow-Corning) en plaçant une épingle de dissection fines que le thorax.
- Enlevez les pattes et les ailes de la mouche. Lors du retrait de l'ensemble le plus postérieure de jambes, de créer une ouverture dans la cuticule au point juste en avant du thorax, où se réunit l'abdomen. Cette ouverture est utilisée plus tard comme un point d'accès pour faire une incision le long de la surface ventrale de l'abdomen (voir étape 5)
- Fixez l'abdomen de la mouche en place en plaçant une épingle de dissection seconde à travers le segment génital.
- Couvrir la volée avec Shields réfrigérés et Sang insectes milieu M3 (Sigma). Retirer les bulles d'air en le dessinant avec une pipette Pasteur.
- En utilisant une pince ouvrir l'abdomen en faisant une incision le long de la ligne médiane ventrale de l'ouverture de la cuticule créé par la suppression des jambes vers le segment génital. Retirer les tripes et les gonades de l'abdomen.
- Sever la cuticule et trachées reliant l'abdomen au thorax. Le tissu ne reste reliant l'abdomen au thorax devrait être le cœur. Ceci fournit la cuticule abdominale avec une certaine stabilité, et l'empêche de tourner ou de torsion lors de la prochaine étape.
- Pin plat antérieur plupart des coins de la cuticule abdominale. Retirez le thorax. Tirer la cuticule tendue, broches plates coins postérieure de la cuticule. La broche dans le segment génital peut être nécessaire de repositionner pour faire la cuticule à plat.
Partie 2. Dissection Oenocyte
La préparation de filet de l'abdomen expose la surface interne de la cuticule abdominale et les tissus attachés, y compris le cœur, le corps gras, trachées, muscles de la paroi du corps, l'épiderme, et les oenocytes. Le coeur se trouve le long de la ligne médiane dorsale. De graisse corporelle (tissu opaque) couvre la plupart de la surface interne cuticulaire. Trachées (blanc structures tubulaires) s'étendent à partir des ouvertures latérales spiracle, et faire des branches étendues qui s'infiltrent dans ces tissus. Situé au pied de ces tissus, la oenocytes pigmentées (couleur ambrée cellules) rayonnent à partir de la ligne médiane au bord latéral de la cuticule dans la région postérieure de chaque segment. Le oenocytes se trouvent directement en dessous des régions brunies par le soleil de chaque tergite (dorsale plaques cuticulaires) et peuvent être difficiles à identifier, sans connaissance préalable de leur emplacement. Une autre population de oenocytes ventralement situé est associée à la sternites (ventrale plaques cuticulaires); bien qu'il soit possible d'isoler ces cellules, ce protocole vidéo sera seulement démontrer la dissection de la oenocytes dorsale. Dans chaque segment abdominal, une feuille de premier plan du tissu de graisse corporelle est antérieur à la oenocytes; une petite feuille de moins évident de graisse corporelle est postérieure à la oenocytes. La feuille d'éminents du tissu de graisse du corps couvre souvent le oenocytes du segment qui le précède. Le vaisseau dorsal et de la graisse corporelle doit être retiré en premier afin d'exposer le oenocytes.
Il est important de noter que la pigmentation de l'ambre oenocytes, d'où le nom de leur dérive (oeno - de oinos grec, «vin») 1, qui distingue clairement ces cellules des tissus environnants; l'intensité de la pigmentation augmente avec l'âge de la mouche. Par ailleurs, une lame basale ensheathes l'2,3 oenocytes, apportant un soutien à l'amas de cellules et d'empêcher les cellules de devenir dissocié lors de la dissection. La lame basale contribue également à l'élimination des tissus extraneously respectées, comme le tissu de graisse du corps, en créant un point faible, où ces adhérences peut facilement être perturbé.
La procédure décrite ci-dessous fournit des instructions détaillées pour l'élimination de la oenocytes du tégument abdominal. Le oenocytes peut être facilement retiré de segments abdominaux 2-5 (mâle) et 2-6 (femelle). Le oenocytes de la première et la dernière segments abdominaux (segments 1, et 6 ou 7 dans les mâles chez les femelles) sont souvent perturbés par les broches de dissection tenant les coins de la cuticule et sont donc évités. La suppression de la oenocytes prend environ 10 minutes à effectuer.
Pour isoler l'oenocytes adulte:
- Sever les troncs trachéale émanant des stigmates à l'aide d'une aiguille de dissection.
- Retirez la graisse du corps et le cœur en coupant les connexions à la surface interne de la cuticule avec une aiguille de dissection. Pour ce faire, placez le point de l'aiguille de dissection entre le corps gras et la oenocytes, et le faire glisser à partir du bord latéral de la cuticule, grâce à la ligne médiane, se déplaçant au-dessous du cœur, et en continuant à côté. Progressant de l'arrière en avant, retirez le tissu de graisse du corps et le cœur de la cuticule de chaque segment successifs. Si bien exécuté l'oenocytes restent attachés à la cuticule, et la graisse du corps et du coeur peut être retiré entier.
- Paroi du corps muscles dragonne l'oenocytes à la surface intérieure de la cuticule. Utilisation de l'aiguille de dissection couper les muscles longitudinaux paroi du corps de chaque segment. Pour ce faire, faites glisser l'aiguille de dissection le long de la face postérieure du brin oenocyte, délicatement les soulever de la surface de la cuticule. Les brins en forme de ruban oenocyte doit se détacher de la cuticule et peut être posé sur le côté tandis que le reste oenocytes sont supprimés.
- Une fois retiré de la cuticule et couché sur la plaque de la dissection, il peut être nécessaire de nettoyer toute respectées tissus de graisse du corps de la oenocytes. Ceci est fait en plaçant simplement l'aiguille de dissection entre le tissu de graisse corporelle et le oenocytes, et la rupture de la connexion en poussant l'aiguille vers le bas et contre la plaque de dissection.
- Rassemblez les brins oenocyte simplement en les poussant avec le bout de l'aiguille de dissection. Une fois collé à l'extrémité de l'aiguille de dissection du oenocytes peut être tiré lentement sur la surface du milieu de culture. Le oenocytes disséqué peuvent être placés directement dans le tampon de lyse cellulaire approprié pour ARN ou d'extraction de protéines. Notez que le oenocytes (segments abdominaux 2-5) à partir d'une mouche mâle unique rendements généralement 15-20ng d'ARN total.
Figure Légende:
Figure 1. L'expression des gènes désaturase, desat1 et desatF, dans oenocytes mâles et femelles de D. melanogaster. transcription inverse-amplification par PCR des desat1 et desatF d'ADNc dérivé de l'adulte oenocytes masculins et féminins. Le gène est exprimé dans desat1 deux oenocytes mâle et femelle, l'expression desatF est un dimorphisme sexuel, étant exprimée exclusivement dans oenocytes femelle. Correspondant à ces différences dans l'expression des gènes, desat1 est nécessaire pour la production de composés d'hydrocarbures communs aux hommes et aux femmes âgées de 9 et desatF est impliqué dans la production de composés d'hydrocarbures spécifiques aux femmes 10,11. DesatF a été montré pour être exprimé spécifiquement au féminin par oenocytes dans 12 hybridation in situ. Notez que, en moyenne 15 20ng d'ARN total est obtenu à partir de l'oenocytes disséqués à partir d'un avion individuel. L'ARN a été isolé en utilisant le micro RNeasy (Qiagen); ADNc a été produite en utilisant les qScript synthèse cDND kit (Quanta Biosciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cet article nous présentons la vidéo d'un protocole de dissection détaillées pour la préparation de la oenocytes de l'adulte D. melanogaster d'une manière appropriée pour l'analyse moléculaire. Une base de texte abrégé compte de la méthode de dissection a été décrit ailleurs 2, et la préparation obtenue oenocyte a été démontré pour être appropriés pour l'extraction de l'ARN et la protéine 2. Utiliser cette préparation, il peut également être possible de développer des méthodes pour la culture de oenocytes explantés. Un protocole pour une culture de l'explant oenocyte aiderait les enquêtes visant à déterminer la capacité autonome du métabolisme de ces cellules à synthétiser et à sécréter des constituants chimiques des hydrocarbures cuticulaires. Ces techniques en combinaison avec un développé récemment oenocyte-Gal4 ligne 4, qui permet la manipulation génétique ciblée de l'oenocytes, permettra l'analyse détaillée de génétique moléculaire de la fonction oenocyte chez la drosophile adulte.
Cellules Oenocyte se trouvent aussi bien dans la larve et la mouche adulte. Bien que ces cellules partagent de nombreuses similarités morphologiques et ultrastructurales, il est important de noter que le oenocytes de la mouche adulte sont développemental distinctes de celles qui se différencient au cours du développement embryonnaire et exister pendant cinq stades larvaires. Le oenocytes adultes ont été signalés à tirer de la 6 histoblastes, formant de novo au cours nymphose et continue à augmenter en nombre durant la première semaine de la vie adulte 7. Alors que le oenocytes de la mouche des fruits adultes sont nécessaires pour la production d'hydrocarbures cuticulaires 4, il reste à déterminer si les larves oenocytes soutenir une fonction similaire. De même, des larves de maintenir oenocytes hépatocytes des fonctions semblables à l'égard du métabolisme lipidique 8; un rôle similaire n'a pas encore été montré pour la oenocytes de l'adulte. La préparation sera démontré ici l'aide des enquêtes qui visent à déterminer la mesure dans laquelle le oenocytes larvaire et adulte sont fonctionnellement similaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Amsale Belay pour son aide dans le tournage de cet article vidéo. Ce travail a été financé par les IRSC, le CRSNG et les subventions à la CRC JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
