Summary
在昆虫中，oenocytes产生表皮碳氢化合物。这些化合物防止干燥和促进化学通讯。在这里，我们展示了一个夹层的技术，用来隔离从成人oenocytes
Abstract
在
Protocol
第1部分。圆角准备的成年果蝇腹部。
立即在下面的准备过程概述腹部oenocytes随后拆除（见议定书第2部分）。同样的程序也可以用于连接到内表面的角质层的其他组织，包括背血管（即心脏）和脂肪体的准备。
请注意，在视频文章oenocyte夹层技术是成年的野生型（广东）男飞，6天的年龄证明。相同的技术可以用于去除雌蝇oenocytes。腹部圆角准备大约需要5分钟来执行。
开始之前重要的是有准备的罚款几个清扫引脚（见下文第2部分）和一个夹层针（见第2部分）。市售清扫如坐针毡此协议往往过大，所以我们已在实验室中制造我们自己的。要创建解剖针，钨丝（0.005“）是第一个线程通过皮下注射针头的轴（27G，铝轮毂）。主题导线通过皮下注射针头的尖端，使其从集线器出现。压线凸出枢纽;防止拔出注射针丝下一步，切压等几个毫米的导线（约3 - 4mm的）从注射针的尖端突出的另一端线的传递。通过火焰的尖端暴露钨丝会激化到非常细点。一个一次性5毫升的塑料吸管时注射针枢纽楔形此清扫工具方便处理的行为。罚款清扫引脚类似使用方式。锐化一步后，抓紧与钳非常尖端的电线，以防止其移动和禁约3mm的尖端释放的小夹层针。护理，防止针被从遥远的把握镊子。
要圆角准备成年果蝇腹部：
- 安全飞行夹层板（Sylgard;陶氏 - 康宁）置于胸部虽然罚款解剖针。
- 删除飞的腿和翅膀。虽然卸下腿最后的设置，创建点前胸部符合腹部在角质层的开放。这种开放是作为一个接入点，沿腹部腹面切口后（见步骤5）
- 安全飞上腹部生殖器段第二解剖针。
- 盖飞用冷冻肉盾牌和桑供应M3的昆虫培养基（Sigma公司）。用巴斯德吸管吸取删除任何被困的空气。
- 使用镊子打开腹部，沿腹中线消除腿部生殖器段创建角质层开幕切口。删除从腹部的胆量和性腺。
- 断绝角质层和气管连接到胸部腹部。剩下的唯一的组织连接到胸部腹部应心。这提供了一些稳定的腹部角质层，防止旋转或扭曲在下一步。
- 针扁平的腹部角质层最前的角落。取出的胸部。拉角质层绷紧，针扁平的角质层后的角落。在生殖器段的脚可能需要重新定位，使角质层平放。
第2部分。 Oenocyte夹层
腹部圆角准备公开腹部角质层和连接的组织，包括心脏，脂肪体，气管，体壁肌肉，表皮，和oenocytes的内部表面。核心在于沿背中线。脂肪体（不透明的组织），涵盖最内部的表皮表面。气管（白管状结构）从横向气门开口，延长，并广泛渗透到这些组织的分支机构。躺在这些组织下，色素oenocytes（琥珀色细胞）从中线外侧边缘的角质层在各分部后地区的辐射。 oenocytes在于直接下每个背片（背表皮板）的重水复疑无路鞣制的地区，可没有事先了解自己的位置难以确定。另一个腹侧位于oenocytes人口与sternites（腹侧表皮板），虽然有可能分离出这些细胞，这个视频协议只能证明背oenocytes清扫。在各腹节，脂肪体组织中的一个突出的叶在于前的oenocytes;脂肪体叶片较小的不太明显的谎言后的oenocytes。脂肪体组织中的突出叶往往涵盖了oenocytes的前面部分。背血管和脂肪体，必须先移除，以揭露的oenocytes。
重要的是要注意的oenocytes琥珀色素沉着，从他们的名字来源于（奥埃诺-从希腊 oînos，“酒”）1，明确区分这些细胞从周围组织的色素沉着的强度与年龄的增长苍蝇。此外，基底层ensheathes oenocytes 2,3，提供支持的细胞团，并防止成为在解剖分离的细胞。基底层还取消extraneously坚持组织，如脂肪体组织，在艾滋病，通过创建一个薄弱点，这些粘连，可以很容易地扰乱。
下文概述的程序提供了详细说明oenocytes去除腹部包膜。 oenocytes可以很容易地从腹部段2-5（男），和2-6（女）。解剖控股的角质层的角落引脚的第一个和最后一个腹段（段1，男性或女性7）oenocytes往往打乱，并因此避免。取消oenocytes大约需要10分钟来执行。
要隔离成人oenocytes：
- 使用夹层针的气孔产生，切断气管树干。
- 切断连接到内表面的角质层与解剖针取出脂肪的身体和心。要做到这一点，位置的夹层之间的脂肪体和oenocytes针点，并拖动从外侧边缘的角质层，通过中线，心脏下方移动，并持续到对面。进步从后到前，去除脂肪的身体组织，从每个连续段的角质层和心脏。如果进行仔细oenocytes保持角质层，和肥胖的身体和心可以删除整个。
- 体壁肌肉表带oenocytes内表面的角质层。用解剖针断绝每个段的纵向体壁肌肉。要做到这一点，拖oenocyte链后，解剖针，轻轻提起他们从表面的角质层。剪彩像oenocyte股应该远离角质层，可铺设到一边，而其余oenocytes被删除。
- 一旦从角质层，躺在夹层板，它可能是必要的清理关闭任何坚持从oenocytes脂肪的身体组织。这是只需将夹层之间的脂肪体组织和oenocytes针，针推下来，对夹层板和切断连接。
- 通过简单地用解剖针戳他们收集oenocyte股。一旦坚持到oenocytes可以拉出整个培养基表面慢慢解剖针年底。解剖oenocytes可以直接放到适合RNA或蛋白质提取的细胞裂解液。请注意，从单一的男性飞oenocytes（2-5腹节）通常产量15 - 20ng的总RNA。
图例：
图1。表达的去饱和酶基因，desat1和desatF D 的男性和女性oenocytes， 果蝇 。逆转录- PCR扩增，从cDNA desat1 和 desatF成年男性和女性oenocytes的所得。 desat1基因的表达在男性和女性oenocytes; desatF表达的是性二态，女性oenocytes表示。通讯desat1这些基因的表达差异，是为烃类化合物，常见的男性和女性 9的生产需要，参与的女性特有的烃类化合物10,11的生产 desatF。desatF已被证明是具体 表现在女性oenocytes 原位杂交12。请注意，平均15 - 20ng总RNA是从个别飞解剖oenocytes获得。 RNA的提取使用的RNeasy微型试剂盒（Qiagen）的cDNA使用qScript cDND合成试剂盒（广达生物科技公司生产）
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Discussion
在这个视频文章中，我们提出了详细的解剖协议，准备从成人oenocytes D. 果蝇的方式适用于分子生物学分析。其他地方2，解剖方法的一个缩写文本为基础的帐户已被描述和oenocyte准备已被证明是适合提取的RNA和蛋白 2 。使用该制剂，它可能也有可能发展explanted oenocytes培养方法。 oenocyte植体文化协议将有助于调查目的是，确定这些细胞的代谢能力的自主的合成和分泌的表皮碳氢化合物的化学成分。结合oenocyte - GAL4最近开发的4号线，它允许目标oenocytes遗传操纵，这些技术将允许在成年果蝇的oenocyte功能的详细的分子遗传分析。
无论是在幼虫和成年飞Oenocyte细胞被发现。虽然这些细胞有许多共同的形态和超微结构的相似之处，重要的是要注意成人飞oenocytes发育分化胚胎发育过程中， 并在5个幼虫阶段存在不同的。成人oenocytes已报道，在化蛹形成从头，并继续在数量上增加 7成人生活的第一周期间， 来自 histoblasts 6。虽然成年果蝇oenocytes 4表皮碳氢化合物的生产需要，但它仍然要确定，如果幼虫oenocytes支持类似的功能。同样，幼虫oenocytes维持肝细胞样的功能与脂质代谢 8，类似的作用尚未显示成人oenocytes。这里展示的制备将援助的目的是确定在何种程度上的幼虫和成人oenocytes功能类似的调查。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢她的协助，在拍摄这段视频文章Amsale扎绳。这项工作是由CIHR，NSERC和CRC赠款JDL。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
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