Summary
Bij insecten, het oenocytes produceren cuticulair koolwaterstofverbindingen. Deze verbindingen te beschermen tegen uitdroging en vergemakkelijken chemische communicatie. Hier laten we zien een dissectie techniek die gebruikt wordt om de oenocytes isoleren van volwassen
Abstract
In
Protocol
Deel 1. Filet de voorbereiding van de volwassen Drosophila buik.
De procedure die onder directe bereidt de buik voor de latere verwijdering van de oenocytes (zie Part2 van het protocol). Dezelfde procedure kan ook worden gebruikt voor de bereiding van de andere weefsels aan de binnenkant van de cuticula, met inbegrip van de dorsale schip (dwz het hart) en vet lichaam.
Merk op dat in de video-artikel de oenocyte dissectie techniek is gedemonstreerd op een volwassen wild-type (Canton-S) mannelijke vliegen, zes dagen oud. Identieke technieken kunnen worden gebruikt om de oenocytes verwijderen van vrouwelijke vliegen. De buik filet voorbereiding duurt ongeveer 5 minuten uit te voeren.
Voor het begin is het belangrijk om klaar meerdere fijne dissectie pinnen (zie hieronder en deel 2) en een dissectie naald (zie deel 2). In de handel verkrijgbare dissectie tintelingen zijn vaak te groot voor dit protocol, dus we hebben genomen om het fabriceren van onze eigen in het lab. Voor het maken van de dissectie naald, wolfraam draad (0.005 ") wordt eerst met schroefdraad door de as van de injectienaald (27G, aluminium hub). Rijg de draad door de punt van de injectienaald, zodat het uit de hub. Crimp de draad uitstekende van de hub;. deze de draad voorkomt wordt getrokken uit de injectienaald Daarna, snijd de draad aan de andere kant van de krimp zo dat een aantal millimeters (~ 3-4mm) van draad steken van de punt van de injectienaald Passing. het topje van de blootgestelde wolfraam door middel van een vlam zal scherpen de draad tot een zeer fijne punt. Een wegwerp plastic pipet 5 ml wanneer ingeklemd in de naaf van de injectienaald fungeert als handig handvat voor deze dissectie tool. De fijne ontleding pennen zijn gemaakt in een soortgelijke manier. Na de verscherping stap, het uiterste puntje van de draad grijpen stevig vast met een tang om te voorkomen dat bewegen en een snee van ongeveer 3 mm van de tip om de kleine dissectie pin los te maken. Wees voorzichtig te pinnen voorkomen dat geslingerd uit de greep van de tang.
Om filet voorbereiding van de volwassen Drosophila buik:
- Bevestig de vliegen naar de dissectie plaat (Sylgard; Dow-Corning) door het plaatsen van een fijne dissectie pin hoewel de thorax.
- Haal de poten en vleugels van de vlieg. Tijdens het verwijderen van de meest achterste set van de benen, maak een opening in de cuticula op het punt net anterior naar de plek waar de thorax de buik voldoet. Deze opening wordt later gebruikt als een access point voor het maken van een incisie langs het ventrale oppervlak van de buik (zie stap 5)
- Maak de buik van de vlieg op zijn plaats door het plaatsen van een seconde dissectie pin door de genitale segment.
- Bedek de vliegen met gekoelde Shields en Sang M3 insect medium (Sigma). Verwijder eventuele ingesloten lucht door gebruik te maken het af met een Pasteur pipet.
- Met behulp van een tang opent de buik door het maken van een incisie langs de ventrale middellijn van de opening in de cuticula gecreëerd door het verwijderen van de benen naar het genitale segment. Verwijder het lef en de geslachtsklieren uit de buik.
- Verbreken van de cuticula en tracheeën het aansluiten van de buik om de thorax. De enige overgebleven weefsel aansluiten van de buik om de thorax moet het hart worden. Dit biedt de buik nagelriem met een zekere stabiliteit, en voorkomt dat het roteren of draaien tijdens de volgende stap.
- Speld vlak van de voorste hoeken van de meest buik cuticula. Verwijder de thorax. Trekken aan de nagelriem strak, pin vlak van de achterste hoeken van de cuticula. De pin in het genitale segment moet mogelijk worden verplaatst om de cuticula plat te leggen.
Deel 2. Oenocyte dissectie
De buik filet voorbereiding blootstelt het interne oppervlak van de buik cuticula en verbonden weefsels waaronder het hart, dik lichaam, luchtpijp, lichaamswand spieren, epidermis, en de oenocytes. Het hart ligt langs de dorsale middellijn. Vet lichaam (ondoorzichtig weefsel) bestrijkt het grootste deel van de interne cuticulair oppervlak. Luchtpijpen (witte buisvormige structuren) uit te breiden van de laterale openingen luchtgat, en maken veel takken die deze weefsels te infiltreren. Liggend onder deze weefsels, de gepigmenteerde oenocytes (amber-gekleurde cellen) stralen van de middenlijn aan de laterale rand van de cuticula in het achterste gebied van elk segment. De oenocytes liggen direct onder de donker gebruinde regio's van elk tergite (dorsale cuticulair platen) en kan moeilijk te identificeren, zonder voorkennis van hun locatie. Een andere populatie van ventraal gelegen oenocytes wordt geassocieerd met de sternites (ventrale cuticulair platen), hoewel het mogelijk is om deze cellen te isoleren, deze video protocol zal alleen tonen de dissectie van de dorsale oenocytes. In elk segment buik, een vooraanstaand blad van vet lichaamsweefsel ligt juist voor de oenocytes, een kleinere, minder voor de hand liggende blad van dik lichaam ligt posterior aan de oenocytes. De prominente blad van dik lichaam weefsel dekt vaak de oenocytes van het segment daaraan voorafgaand. De dorsale vat en vet lichaam moet eerst worden verwijderd om de oenocytes bloot te leggen.
Het is belangrijk op te merken dat de oranje pigmentatie van de oenocytes, waarvan het de naam is afgeleid (Oeno - uit het Grieks oinos, 'wijn') 1, duidelijk onderscheidt deze cellen uit de omliggende weefsels, de intensiteit van de pigmentatie neemt toe met de leeftijd van de vlieg. Bovendien is een basale lamina ensheathes de oenocytes 2,3, ondersteuning van de cel clusters en het voorkomen van de cellen van steeds los tijdens de dissectie. De basale lamina helpt ook bij het verwijderen van extraneously gehandeld weefsels, zoals vet weefsel, door het creëren van een zwak punt waar deze verklevingen gemakkelijk kan worden verstoord.
De hieronder beschreven procedure bevat gedetailleerde instructies voor het verwijderen van de oenocytes uit de buik integument. De oenocytes kan eenvoudig worden verwijderd uit de buik segmenten 2-5 (mannelijke), en 2-6 (vrouwelijk). De oenocytes uit de eerste en de laatste abdominale segmenten (segmenten 1 en 6 of 7 bij mannen bij vrouwen) worden vaak verstoord door de dissectie spelden die de hoeken van de cuticula en zijn daarom vermeden. De verwijdering van de oenocytes duurt ongeveer 10 minuten uit te voeren.
Om de volwassen oenocytes te isoleren:
- Sever de tracheale stammen die voortvloeien uit de siphonen met behulp van een dissectie naald.
- Verwijder het vet lichaam en hart door verbreken van de verbindingen met de binnenkant van de nagelriem met een dissectie naald. Om dit te doen, plaatst u de punt van de dissectie naald tussen het vet lichaam en de oenocytes, en sleep deze van de laterale rand van de cuticula, door middel van aan de middellijn, bewegen onder het hart, en blijven andere kant. Vorderen van de achterste naar voorste, verwijder het vet lichaamsweefsel en het hart van de cuticula van elke opeenvolgende segment. Indien zorgvuldig uitgevoerd de oenocytes gehecht blijven aan de nagelriem, en het vet het lichaam en het hart kan worden verwijderd geheel.
- Lichaamswand spieren band de oenocytes aan de binnenkant van de cuticula. Met behulp van de dissectie naald verbreken in de lengterichting lichaam muur spieren van elk segment. Om dit te doen, sleept u de dissectie naald langs de achterzijde van de oenocyte streng, voorzichtig op te tillen ze van het oppervlak van de cuticula. Het lint-achtige oenocyte strengen moeten uit de buurt komen van de cuticula en kan worden gelegd aan de kant, terwijl de resterende oenocytes worden verwijderd.
- Na verwijdering van de cuticula en liggend op de dissectie plaat kan het nodig zijn om schoon te maken elke gehandeld op grond van dik lichaam weefsel van de oenocytes. Dit wordt gedaan door simpelweg het plaatsen van de dissectie naald tussen de vette lichaamsweefsel en de oenocytes, en verbreken de verbinding door op de naald naar beneden en tegen de dissectie plaat.
- Verzamel de oenocyte strengen door simpelweg prikken ze met het einde van de dissectie naald. Eenmaal vast aan het einde van de dissectie van de naald oenocytes langzaam kan worden getrokken over het oppervlak van het kweekmedium. De ontleed oenocytes kunnen direct worden geplaatst in cel lysis buffer geschikt voor zowel RNA of eiwit-extractie. Merk op dat de oenocytes (abdominale segmenten 2-5) uit een enkele mannelijke fly typisch 15-20ng totaal RNA oplevert.
Figuur Legenda:
Figuur 1. Expressie van de genen desaturase, desat1 en desatF, bij mannelijke en vrouwelijke oenocytes van D. melanogaster. Reverse transcriptie-PCR-amplificatie van desat1 en desatF van cDNA afkomstig van volwassen mannelijke en vrouwelijke oenocytes. De desat1 gen wordt uitgedrukt in zowel mannelijke als vrouwelijke oenocytes; desatF uitdrukking is seksueel dimorfe, worden uitsluitend uitgedrukt in vrouwelijke oenocytes. Die overeenkomen met deze verschillen in genexpressie, is desat1 nodig voor de productie van koolwaterstofverbindingen voor beide mannen en vrouwen van 9, en desatF is betrokken bij de productie van vrouwelijke-specifieke koolwaterstofverbindingen 10,11. DesatF is aangetoond dat het specifiek worden uitgedrukt in vrouwelijke oenocytes door in situ hybridisatie 12. Merk op dat de gemiddelde 15-20ng van totaal RNA wordt verkregen uit de oenocytes ontleed van een individuele vliegen. RNA werd geïsoleerd met behulp van de RNeasy micro kit (Qiagen), cDNA werd geproduceerd met behulp van de qScript cDND synthese kit (Quanta BioSciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video artikel geven we een gedetailleerde dissectie protocol voor de voorbereiding van de oenocytes van volwassen D. melanogaster op een manier die geschikt is voor moleculaire analyse. Een verkorte tekst gebaseerde rekening van de dissectie methode is elders 2 beschreven, en de daaruit voortvloeiende oenocyte preparaat is aangetoond dat geschikt is voor de winning van zowel RNA en eiwit 2. Met behulp van deze voorbereiding kan het ook mogelijk zijn om methoden voor het kweken van geëxplanteerde oenocytes te ontwikkelen. Een protocol voor een oenocyte explantatie cultuur zou de steun onderzoeken die gericht zijn op het bepalen van de autonome metabole capaciteit van deze cellen om te synthetiseren en afscheiden van de chemische bestanddelen van cuticulaire koolwaterstoffen. Deze technieken in combinatie met een recent ontwikkelde oenocyte-Gal4 lijn 4, die de gerichte genetische manipulatie van de oenocytes het toelaat, zal voor de gedetailleerde moleculaire genetische analyse van oenocyte functie in de volwassen fruitvlieg.
Oenocyte-cellen worden gevonden, zowel in de larve en de volwassen vlieg. Hoewel deze cellen delen vele morfologische en ultrastructurele gelijkenissen, is het belangrijk op te merken dat de oenocytes van de volwassen vliegen zijn ontwikkelingsachterstand onderscheiden van degenen die onderscheid maken tijdens de embryonale ontwikkeling en het bestaan tijdens de larvale stadia 5. De volwassen oenocytes zijn gemeld te worden ontleend aan de histoblasts 6, de vorming van de novo Tijdens het popstadium en blijven in aantal toenemen tijdens de eerste week van het volwassen leven 7. Terwijl de oenocytes van de volwassen fruitvlieg nodig zijn voor de productie van koolwaterstoffen cuticulaire 4, moet nog worden vastgesteld of larvale oenocytes ondersteunt een soortgelijke functie. Ook larven oenocytes onderhouden hepatocyt-achtige taken met betrekking tot lipidenmetabolisme 8; een gelijkaardige rol is nog niet aangetoond voor de oenocytes van de volwassene. De voorbereiding laten zien hier zal de steun onderzoeken die gericht zijn op het vaststellen van de mate waarin de larven en volwassen oenocytes hebben een soortgelijke functionaliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Amsale Belay bedanken voor haar hulp bij het filmen van deze video artikel. Dit werk werd gefinancierd door CIHR, NSERC en CRC beurzen aan JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
