Summary
Bei den Insekten produzieren oenocytes Kutikula Kohlenwasserstoffverbindungen. Diese Verbindungen gegen Austrocknung zu schützen und zu erleichtern chemische Kommunikation. Hier zeigen wir eine Dissektionstechnik verwendet, um die oenocytes von Erwachsenen zu isolieren
Abstract
In
Protocol
Teil 1. Filet Vorbereitung der erwachsenen Drosophila Bauch.
Das beschriebene Verfahren unmittelbar unterhalb bereitet den Bauch für die anschließende Entfernung des oenocytes (siehe Teil 2 des Protokolls). Das gleiche Verfahren kann auch zur Herstellung der anderen Gewebe an der inneren Oberfläche der Kutikula, einschließlich der dorsalen Gefäß (dh Herz) und fetten Körper verwendet werden.
Beachten Sie, dass in der Video-Artikel der oenocyte Dissektionstechnik auf einen Erwachsenen-Wildtyp (Canton-S) männliche Fliege, 6 Tage alt ist bewiesen. Identische Techniken können verwendet werden, um die oenocytes von weiblichen Fliegen zu entfernen. Der Bauch Filet Vorbereitung dauert ca. 5 Minuten in Anspruch.
Vor Beginn ist es wichtig, bereit mehreren feinen Sezierung Pins (siehe unten und Teil 2) und eine Dissektion Nadel (siehe Teil 2). Kommerziell erhältliche Dissektion Nadeln sind oft zu groß für dieses Protokoll, so müssen wir unsere eigene Herstellung im Labor entnommen. Zum Erstellen der Dissektion Nadel-, Wolfram-Draht (0,005 ") wird zunächst durch die Welle der Injektionsnadel (27G-, Aluminium-Nabe) eingefädelt. Fädeln Sie den Draht durch die Spitze der Injektionsnadel, so dass es von der Nabe entsteht. Crimp ragende Drahtende von der Nabe;. diese den Draht verhindert das Herausziehen der Injektionsnadel Next, schneiden Sie den Draht am anderen Ende der Sicke, so dass mehrere Millimeter (~ 3-4mm) aus Draht von der Spitze der Injektionsnadel ragen Passing. die Spitze ausgesetzt Wolfram durch eine Flamme wird der Draht zu einem sehr feinen Spitze zu schärfen. Ein Einweg-5ml Plastikpipette, wenn sie in die Nabe der Injektionsnadel verkeilt fungiert als praktischer Griff für diese dissection tool. Die feinen Sezierung Stifte in einer ähnlichen gemacht werden Weise. Nach dem Schärfen, fassen Sie die Spitze der Leiter fest mit einer Pinzette, um es von Bewegung zu verhindern und einen Schnitt von ca. 3 mm von der Spitze des kleinen Dissektion PIN freigibt. Sie vorsichtig, um Pin davon entfernt, aus den Händen schleuderte verhindern der Zange.
Um Filet bereiten die erwachsenen Drosophila Bauch:
- Sichern Sie die fliegen, um die Zerlegung Platte (Sylgard; Dow-Corning), indem Sie einen feinen Sezierung pin obwohl der Thorax.
- Entfernen Sie die Beine und Flügel der Fliege. Beim Entfernen der hinteren Reihe von Beinen, schaffen eine Öffnung in der Kutikula an der Stelle, knapp vor dem Brustkorb Unterleib trifft. Diese Öffnung wird später als Access Point für ein Einschnitt entlang der ventralen Oberfläche des Bauches verwendet werden (siehe Schritt 5)
- Sichern Sie den Bauch der Fliege statt, indem eine zweite Sektion Stift durch die Genital-Segment.
- Decken Sie die Fliege mit gekühltem Shields und Sang M3 Insekten Medium (Sigma). Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie ihn mit einer Pasteurpipette.
- Mit einer Pinzette den Bauch durch einen Einschnitt entlang der ventralen Mittellinie von der Öffnung in der Kutikula, indem Sie die Beine auf den Genitalbereich Segment geschaffen. Entfernen Sie die Eingeweide und Keimdrüsen aus dem Bauch.
- Sever die Kutikula und Tracheen Anschluss der Bauch, die Brust. Die einzige verbleibende Gewebe verbindet den Bauch, die Brust sollte das Herz sein. Dies bietet die abdominale Nagelhaut mit einer gewissen Stabilität und verhindert das Drehen oder Verdrehen während der nächste Schritt.
- Pin flachen vorderen meisten Ecken der abdominalen Nagelhaut. Entfernen Sie den Brustkorb. Pulling die Kutikula straff, polige Flachbandkabel den hinteren Ecken der Nagelhaut. Der Stift im Genitalbereich Segment müssen eventuell neu positioniert, um die Schuppenschicht flach sein.
Part 2. Oenocyte Dissektion
Der Bauch Filet Vorbereitung macht die innere Oberfläche der abdominalen Kutikula und befestigt Gewebe einschließlich des Herzens, dicken Körper, Tracheen, Körperwand Muskeln, Haut, und die oenocytes. Das Herz liegt entlang der dorsalen Mittellinie. Fat Körper (undurchsichtiges Gewebe) deckt die meisten der internen Kutikula Oberfläche. Tracheen (weiß röhrenförmige Strukturen) von den seitlichen Öffnungen Luftloch zu erweitern, ebenso wie den intensiven Branchen, die diese Gewebe zu infiltrieren. Darunter liegenden diesen Geweben, die pigmentierte oenocytes (bernsteinfarben Zellen) strahlen von der Mittellinie auf den seitlichen Rand der Kutikula in der hinteren Region der einzelnen Segmente. Die oenocytes liegen direkt unter dem schwarz gebrannten Regionen jedes Tergit (dorsal cuticularen Platten) und schwierig sein kann, ohne Vorkenntnisse von ihrem Standort zu identifizieren. Eine weitere Population von ventral gelegenen oenocytes mit dem sternites (ventral cuticularen Platten) assoziiert, obwohl es möglich ist, diese Zellen zu isolieren, das Video-Protokoll wird nur demonstrieren die Dissektion der dorsalen oenocytes. In jedem Abdominalsegment liegt ein prominenter Blatt von Fett Körpergewebe anterior der oenocytes, ein kleinerer weniger offensichtlich Blatt fetten Körper liegt hinter der oenocytes. Der prominente Blatt von Fett Körpergewebe deckt die oft oenocytes des Segments vorangeht. Die dorsale Gefäß und fetten Körper muss zuerst entfernt werden, um die oenocytes aussetzen.
Es ist wichtig zu beachten, dass die gelbe Pigmentierung der oenocytes, aus denen die ihren Namen verdankt (oeno - aus dem Griechischen Oinos, "Wein") 1, deutlich unterscheidet diese Zellen aus dem umliegenden Gewebe, die Intensität der Pigmentierung steigt mit dem Alter der Fliege. Darüber hinaus umhüllt eine Basallamina der oenocytes 2,3, die Unterstützung der Zellhaufen und die Verhinderung der Zellen, die aus immer während der Präparation dissoziiert. Die Basallamina hilft auch bei der Entfernung von extraneously eingehalten Gewebe wie Fett Körpergewebe, indem sie einen schwachen Punkt, wo diese Adhäsionen leicht gestört werden kann.
Die im Folgenden beschriebene Vorgangsweise enthält detaillierte Anweisungen für die Beseitigung der oenocytes aus der Bauchhaut. Die oenocytes kann leicht aus Abdominalsegmente 2-5 (männlich) und 2-6 (weiblich) entfernt werden. Die oenocytes aus der ersten und letzten Abdominalsegmente (Segmente 1 und 6 bei Männern und 7 bei Frauen) sind oft durch die Dissektion Stifte halten die Ecken der Kutikula gestört und sind daher zu vermeiden. Die Entfernung der oenocytes dauert ca. 10 Minuten in Anspruch.
Um die Erwachsenen oenocytes isolieren:
- Sever die tracheale Stämme, die aus der Luftlöcher mit einer Dissektion Nadel.
- Entfernen Sie die fetten Körper und Herz durch die Lösung der Anbindung an die innere Oberfläche der Kutikula mit einer Dissektion Nadel. Dazu positionieren Sie den Punkt der Dissektion Nadel zwischen den fetten Körper und die oenocytes, und ziehen Sie es aus dem seitlichen Rand der Kutikula, bis hin zu der Mittellinie bewegen unterhalb des Herzens, und weiterhin gegenüberliegenden Seite. Fortschritt von der hinteren zur vorderen, entfernen Sie das Fett Körpergewebe und das Herz aus der Kutikula von jeder nachfolgenden Segment. Wenn durchgeführt sorgfältig die oenocytes bleiben an der Kutikula, und die fetten Körper und Herz entnommen Ganzes.
- Körper Wand Muskeln Gurt der oenocytes auf die innere Oberfläche der Kutikula. Mit der Zerlegung Nadel sever Längs Körperwand Muskeln der einzelnen Segmente. Dazu ziehen Sie die Dissektion Nadel entlang der hinteren Seite des oenocyte Strang, leichtes Anheben sie von der Oberfläche der Kutikula. Die bandartigen Strängen oenocyte kommen sollte, weg von der Nagelhaut und kann auf die Seite gelegt werden, während die restlichen oenocytes entfernt werden.
- Einmal von der Nagelhaut entfernt und liegt auf dem Sezieren Platte kann es erforderlich sein, um sauber aus allen eingehalten Fett Körpergewebe aus dem oenocytes. Dies ist durch einfaches Auflegen der Dissektion Nadel zwischen dem Fett-Gewebe und die oenocytes und Trennen der Verbindung, indem Sie die Nadel nach unten und gegen die Dissektion Platte gemacht.
- Sammeln Sie die oenocyte Stränge durch einfaches Stoßen sie mit dem Ende der Dissektion Nadel. Einmal bis ans Ende der Dissektion Nadel die oenocytes langsam kann über die Oberfläche des Kulturmediums gezogen werden geklebt. Die seziert oenocytes können direkt in Zell-Lyse-Puffer geeignet für entweder RNA oder Protein-Extraktions-gelegt werden. Beachten Sie, dass die oenocytes (Abdominalsegmente 2-5) von einem einzigen Männchen fliegen in der Regel liefert 15-20ng Gesamt-RNA.
Abbildung Legende:
Abbildung 1. Expression der Desaturase-Gene, desat1 und desatF, in männliche und weibliche oenocytes von D. melanogaster. Reverse Transkription-PCR-Amplifikation von desat1 und desatF aus cDNA von ausgewachsenen männlichen und weiblichen oenocytes abgeleitet. Die desat1 Gen ist in männliche und weibliche oenocytes ausgedrückt; desatF Ausdruck geschlechtsdimorphischen, ausschließlich in weiblichen oenocytes ausgedrückt. Entsprechend diesen Unterschieden in der Genexpression, ist desat1 für die Produktion von Kohlenwasserstoff-Verbindungen, die für beide Männchen und Weibchen 9 erforderlich und desatF ist in der Herstellung von spezifisch weiblichen Kohlenwasserstoffverbindungen 10,11 beteiligt. DesatF hat sich gezeigt, dass spezifisch exprimiert werden bei weiblichen oenocytes durch in situ Hybridisierung 12. Beachten Sie, dass im Durchschnitt 15-20ng Gesamt-RNA aus dem oenocytes aus einer einzelnen Fliege seziert erreicht ist. RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Micro Kit (Qiagen); cDNA wurde unter Verwendung des qScript cDND Synthese-Kit (Quanta Biosciences)
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Discussion
In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Analyse-Protokoll für die Vorbereitung der oenocytes aus adulten D. melanogaster in einer geeigneten Art und Weise für die molekulare Analyse. Eine gekürzte Text-basierte Darstellung der Dissektion Methode wurde an anderer Stelle 2, beschrieben und die daraus resultierenden oenocyte Vorbereitung hat sich gezeigt, angemessen für die Extraktion der beiden RNA-und Protein-2. Mit dieser Vorbereitung kann es auch möglich, Methoden zur Kultivierung von explantierten oenocytes entwickeln. Ein Protokoll für eine oenocyte Explantation Kultur würde Hilfe Untersuchungen an der Bestimmung der autonomen metabolische Kapazität dieser Zellen zu synthetisieren und sezernieren die chemischen Bestandteile der Kutikula Kohlenwasserstoffe sollen. Diese Techniken in Kombination mit einem neu entwickelten oenocyte-Gal4 Linie 4, die die gezielte genetische Manipulation der oenocytes erlaubt, werden für die detaillierte molekulargenetische Analyse von oenocyte Funktion im erwachsenen Fruchtfliege zu ermöglichen.
Oenocyte Zellen sind sowohl in der Larve und die erwachsenen Fliegen gefunden. Während diese Zellen viele morphologische und ultrastrukturelle Gemeinsamkeiten teilen, ist es wichtig zu beachten, dass die oenocytes der erwachsenen Fliegen entwicklungspolitisch unterscheiden sich von denen, die während der embryonalen Entwicklung zu differenzieren und bei Larvenstadien 5 vorliegen werden. Die erwachsenen oenocytes wurde berichtet, dass aus dem histoblasts 6 abgeleitet werden, wobei de novo während der Verpuppung und weiterhin an der Zahl in der ersten Woche des Erwachsenenlebens 7 zu erhöhen. Während die oenocytes der erwachsenen Fruchtfliege für die Herstellung von Kutikula Kohlenwasserstoffe 4 sind erforderlich, bleibt zu prüfen, ob Larven oenocytes eine ähnliche Funktion zu unterstützen. Ebenso halten Larven oenocytes Hepatozyten-ähnliche Funktionen in Bezug auf den Fettstoffwechsel 8; eine ähnliche Rolle ist noch nicht für den oenocytes der Erwachsenen gezeigt worden. Die Vorbereitung hier gezeigt werden, dass Untersuchungen bei der Bestimmung der Grad, zu dem die Larven und erwachsenen oenocytes sind funktional ähnlich ausgerichtet sind zu helfen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Amsale Belay für ihre Unterstützung danken Dreharbeiten zu diesem Video Artikel. Diese Arbeit wurde von CIHR, NSERC und CRC gewährt JDL finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
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