Summary
בשנת חרקים, oenocytes לייצר תרכובות פחמימנים cuticular. תרכובות אלו להגן מפני התייבשות ולאפשר תקשורת כימית. כאן אנו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש כדי לבודד את oenocytes מן הבוגרים
Abstract
בתוך
Protocol
חלק 1. הכנת פילה של הבטן תסיסנית מבוגר.
ההליך המתואר להלן מיידית מכין את הבטן להסרת הבאות של oenocytes (ראה Part2 של פרוטוקול). ההליך אותו יכול לשמש גם להכנת ברקמות אחרות המצורפת המשטח הפנימי של לציפורן, כולל כלי הגבי (כלומר לב) ואת השומן בגוף.
שים לב כי במאמר וידאו הטכניקה לנתיחה oenocyte מודגם על לטוס מבוגר (קנטון-S) wild-type זכר, שישה ימים של גיל. טכניקות זהים ניתן להשתמש כדי להסיר את oenocytes מפני זבובים ממין נקבה. הכנת פילה הבטן לוקח כ 5 דקות לבצע.
לפני תחילת חשוב להיות מוכן כמה סיכות לנתיחה קנס (ראה להלן חלק 2) ו מחט דיסקציה (ראו חלק 2). סיכות לנתיחה זמין מסחרית ומחטים לעיתים גדול מדי עבור פרוטוקול זה, אז נקטנו כדי בודה שלנו במעבדה. כדי ליצור את המחט לנתיחה, תיל טונגסטן (0.005 ") הוא מושחל הראשונה דרך הפיר של מחט המזרק (27G, אלומיניום רכזת). תיל נושא באמצעות קצה המחט של המזרק, כך עולה מן הרכזת. מסלסלים את חוט בולטות מהרכזת;. זה מונע את החוט מלהיות שלף את המחט של המזרק הבא, לחתוך את החוט בקצה השני של כאלה crimp כי כמה מילימטרים (~ 3-4 מ"מ) של תיל בולטים קצה המחט של המזרק עובר. קצה טונגסטן נחשפים דרך להבה יהיה לחדד את החוט עד לנקודה טובה מאוד. פלסטיק חד פעמיות 5 מ"ל פיפטה כאשר תקוע לרכזת המחט של המזרק משמש ידית נוחה כלי זה לנתיחה. סיכות לנתיחה בסדר מתקבלות דומה הדרך. לאחר השלב השחזה, לתפוס את קצה קצהו של חוט חזק עם מלקחיים כדי למנוע ממנה לזוז ולעשות חתך כ 3mm מהקצה לשחרר את הנצרה לנתיחה קטן. השתמש טיפול כדי למנוע סיכה מלהיות השליך מידיו של מלקחיים.
פילה כדי להכין את הבטן מבוגר תסיסנית:
- אבטח את לטוס הצלחת דיסקציה (Sylgard; Dow-Corning) על ידי הצבת סיכה לנתיחה בסדר למרות החזה.
- הסר את רגליים וכנפיים של זבוב. בעוד הסרת להגדיר האחורי ביותר של הרגליים, ליצור פתח לציפורן בנקודה קדמית רק למקום החזה פוגש את הבטן. פתח זה משמש מאוחר יותר נקודת גישה עבור ביצוע חתך על פני השטח הגחוני של הבטן (ראה שלב 5)
- אבטח את הבטן של הזבוב במקום על ידי הצבת סיכה לנתיחה השנייה ועד במגזר באברי המין.
- מכסים את לעוף עם שילדס צונן סאנג M3 חרקים בינוני (Sigma). הסר את כל האוויר שנלכד על ידי ציור אותו עם פיפטה פסטר.
- מלקחיים שימוש לפתוח את הבטן על ידי ביצוע חתך לאורך קו האמצע הגחון מפתיחת ב לציפורן נוצר על ידי הסרת הרגליים למגזר באברי המין. הסר את האומץ ואת בלוטות המין מן הבטן.
- סבר העור המת tracheae המחבר את הבטן אל החזה. הרקמה היחידה שנותרה המחבר את הבטן אל החזה צריך להיות הלב. זה מספק את לציפורן בטן עם יציבות מסוימת, ומונעת ממנו סיבוב או פיתול במהלך לשלב הבא.
- פין שטוח הקדמי פינות ביותר לציפורן הבטן. הסר את בית החזה. משיכת לציפורן מתוח, פין שטוח בפינות האחורי של לציפורן. סיכה במגזר המין ייתכן שיהיה צורך מיקומו לעשות לציפורן שכב.
חלק 2. Oenocyte לנתיחה
הכנת פילה הבטן חושף את פני השטח הפנימי של לציפורן הבטן וברקמות המצורף כולל הלב, שומן הגוף, tracheae, קיר שרירי הגוף, האפידרמיס, ואת oenocytes. הלב נמצא לאורך קו האמצע הגבי. גוף שומן (רקמת אטום) מכסה את רוב השטח cuticular פנימי. Tracheae (מבנים צינורי לבן) להאריך מן הפתחים spiracle לרוחב, ולעשות סניפים נרחבת אשר לחדור רקמות אלה. שוכבת מתחת רקמות אלו, oenocytes פיגמנטציה (בצבע ענבר תאים) מקרינים מן קו האמצע לקצה הלטרלי של לציפורן באזור האחורי של כל פלח. Oenocytes השקר ישירות מתחת האזורים שזוף של כל tergite (צלחות cuticular הגבי) והוא יכול להיות קשה לזהות ללא ידיעה מוקדמת של מיקומם. אוכלוסייה נוספת של oenocytes ממוקם ventrally המשויך sternites (צלחות cuticular הגחון); למרות שזה אפשרי לבודד תאים אלה, זה פרוטוקול וידאו רק להדגים את דיסקציה של oenocytes הגבי. בכל מגזר בטן, עלה הבולטים של רקמת השומן בגוף השקרים הקדמי של oenocytes; עלה פחות ברורים יותר של שומן גוף השקרים האחורי של oenocytes. העלה הבולטים של רקמת השומן בגוף לעיתים קרובות מכסה את oenocyteים של המגזר שקדמו לו. הספינה הגב ואת השומן בגוף יש להסיר תחילה כדי לחשוף את oenocytes.
חשוב לציין כי הפיגמנטציה של ענבר oenocytes, שממנו נגזר שמם (oeno - מ oînos היווני, "יין") 1, מבדיל בבירור בין תאים אלה הרקמות הסובבות, את עוצמת פיגמנטציה עולה עם הגיל של הזבוב. יתר על כן, basal lamina ensheathes oenocytes 2,3, מתן תמיכה צבירי תאים ומונעים את התאים מלהפוך ניתק במהלך הניתוח. Basal lamina גם מסייע להסרת רקמות דבק בקור, כגון רקמת השומן בגוף, על ידי יצירת נקודת התורפה שבו אלה הידבקויות יכולה להיות מופרת בקלות.
ההליך המפורטים להלן מספק הוראות מפורטות להסרת oenocytes מן integument הבטן. Oenocytes ניתן להסיר בקלות מכל המגזרים בטן 2-5 (זכר) ו 2-6 (נקבה). Oenocytes מן המגזרים הבטן הראשונה והאחרונה (קטעים 1, 6 או 7 אצל זכרים אצל נקבות) הם שיבשו לעתים קרובות על ידי סיכות לנתיחה מחזיק בפינות לציפורן, ולכן נמנעים. הסרת oenocytes לוקח כ -10 דקות לביצוע.
כדי לבודד את oenocytes מבוגר:
- סבר הגזעים קנה הנשימה הנובעות spiracles באמצעות מחט לנתיחה.
- הסר את הגוף הלב שומן על ידי ניתוק הקשרים על פני השטח הפנימי של לציפורן עם מחט לנתיחה. לשם כך, מקם את חוד המחט לנתיחה בין שומן הגוף ואת oenocytes, ולגרור אותו מהקצה לרוחב של לציפורן, דרך קו האמצע, נע מתחת הלב, ממשיך בצד הנגדי. מתקדמת מ האחורי אל הקדמי, להסיר את רקמת השומן בגוף ואת הלב מן לציפורן של כל פלח רצופים. אם מבוצע בקפידה oenocytes נשארים מחוברים לציפורן, והגוף לב שומן ניתן להסיר את כולו.
- קיר גוף רצועת השרירים oenocytes אל פני השטח הפנימי של לציפורן. באמצעות מחט לנתיחה לנתק קיר האורך שרירי הגוף של כל פלח. כדי לעשות זאת, גרור את המחט לנתיחה בצד האחורי של גדיל oenocyte, מרימים בעדינות אותם מפני השטח של לציפורן. סרט דמוי חוטים oenocyte צריך לבוא ממנו לציפורן, ניתן להניח בצד בעוד oenocytes שנותרו יוסרו.
- הוסר לאחר מן לציפורן, שוכב על הצלחת לנתיחה ייתכן שיהיה צורך לנקות את כל דבק רקמות השומן בגוף מ oenocytes. זה נעשה פשוט על ידי הצבת מחט לנתיחה בין רקמת השומן בגוף ואת oenocytes, וניתוק הקשר על ידי דוחפים את המחט למטה על הצלחת הניתוח.
- אסוף את גדילי oenocyte פשוט על ידי תוקעת אותם בסופו של המחט לנתיחה. תקוע לאחר לסוף המחט לנתיחה oenocytes יכול להיות משך לאט על פני השטח של המדיום לתרבות. Oenocytes גזור יכול להיות ממוקם ישירות לתוך חוצץ התא תמוגה מתאים או RNA או מיצוי חלבון. שים לב oenocytes (קטעים בטן 2-5) מ זבוב זכר יחיד בדרך כלל מניבה 15-20ng של רנ"א מוחלט.
איור מקרא:
באיור 1. הביטוי של הגנים desaturase, desat1 ו desatF, ב oenocytes זכר ונקבה של ד melanogaster. הגברה הפוך שעתוק-PCR של desat1 ו desatF מ cDNA נגזר oenocytes זכר ונקבה בוגרים. הגן desat1 מתבטא הן oenocytes זכר ונקבה; ביטוי desatF הוא דימורפית מינית, בא לידי ביטוי באופן בלעדי oenocytes הנשי. מקבילים להבדלים ביטוי גנים, desat1 נדרש לייצור תרכובות פחמימנים המשותפים לשני זכרים ונקבות 9, desatF עוסקת בייצור של נשים ספציפיות תרכובות פחמימנים 10,11. DesatF הוכח לידי ביטוי במיוחד ב oenocytes הנשי על ידי ב 12 הכלאה באתרה. שים לב כי בממוצע 15-20ng של רנ"א הכל מתקבל oenocytes גזור מן לטוס אדם. RNA היה מבודד באמצעות RNeasy ערכת מיקרו (Qiagen); cDNA הופק באמצעות cDND qScript סינתזה הערכה (Quanta BioSciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה אנו מציגים וידאו פרוטוקול לנתיחה מפורט להכנת oenocytes מן הבוגרים ד melanogaster באופן מתאים לניתוח מולקולרית. מבוססי טקסט חשבון מקוצר של השיטה לנתיחה תוארה במקומות אחרים 2, והכנת oenocyte וכתוצאה מכך הודגמה להיות מתאים החילוץ של שניהם RNA וחלבון 2. באמצעות הכנה זו ניתן גם ניתן לפתח שיטות culturing של oenocytes explanted. פרוטוקול לתרבות explant oenocyte תסייע חקירות שנועדו לקבוע את יכולת חילוף החומרים אוטונומי של תאים אלה מפרישים לסנתז את המרכיבים הכימיים של פחמימנים cuticular. אלו טכניקות בשילוב עם קו oenocyte-Gal4 פיתחה לאחרונה 4, אשר מאפשרת מניפולציה גנטית ממוקד של oenocytes, תאפשר ניתוח מפורט גנטיקה מולקולרית של פונקציה oenocyte ב זבוב הפירות הבוגרים.
תאים Oenocyte נמצאים הן הזחל לבין לטוס מבוגר. בעוד תאים אלה חולקים דמיון מורפולוגיים ultrastructural רבים, חשוב לציין כי oenocytes של הזבוב הבוגר נבדלים מבחינה התפתחותית מאלו להבדיל במהלך ההתפתחות העוברית קיים בשלבי הזחל 5. Oenocytes המבוגר דווחו להיגזר histoblasts 6, ויוצרים דה נובו במהלך התגלמות והמשך העלייה במספר במהלך השבוע הראשון של חייו הבוגרים 7. בעוד oenocytes של זבוב הפירות הבוגרים נדרשים לייצור פחמימנים cuticular 4, זה עדיין לא נקבע אם oenocytes הזחל תמיכה פונקציה דומה. כמו כן, oenocytes הזחל לשמור hepatocyte כמו פונקציות ביחס מטבוליזם השומנים 8; תפקיד דומה טרם הוכח עבור oenocytes של המבוגר. הכנה הראו כאן יסייעו החקירות נועדו לקבוע את המידה שבה oenocytes הזחל והבוגר דומים מבחינה תפקודית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Amsale זוזו על סיועה הצילומים של מאמר זה וידאו. עבודה זו מומנה על ידי CIHR, NSERC ומענקים CRC כדי JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
