Summary
昆虫では、oenocytesはクチクラ炭化水素化合物を生成する。これらの化合物は、乾燥を防ぎ、化学物質のコミュニケーションを促進する。ここでは、大人からoenocytesを分離するために使用される解剖の技術を実証
Abstract
の
Protocol
パート1。大人ショウジョウバエの腹部のフィレット作成。
手順は下記の即時の説明（プロトコルのその2を参照）oenocytesのその後の除去のための腹部を準備します。同じ手順は、背脈管（すなわち心臓）と脂肪体を含む、キューティクルの内側の表面に付着した他の組織、の準備のためにも使用できます。
ビデオの記事でoenocyte解剖手法が大人の野生型（カントン- S）男性のフライ、年齢の六日間で実証されていることに注意してください。同一の技術は、女性のハエからoenocytesを削除することができます。腹部のフィレットの準備は、実行するために約5分かかります。
始める前にそれは（パート2を参照）準備ができていくつかの細かい解剖ピン（下記参照および第2部）と解剖針を持つことが重要です。市販の解剖ピンと針は、このプロトコルのためにしばしば大きすぎるので、研究室で独自に作製するために取られている。解剖針を作成するには、タングステン線は（0.005"）最初の皮下注射針のシャフト（27G、アルミハブ）を介してスレッド化されています。スレッドは、ワイヤは、皮下注射針の先端によっては、ハブから出てくるように。突出線を圧着ハブから、これは注射針から引き出されてからワイヤを防止次に、ワイヤーの数mm（〜3〜4ミリメートル）を皮下注射針の先端から突出している圧着などの反対側の端にワイヤーを切る渡す。炎を介して公開されたタングステンの先端は非常に細かい点まで線をシャープになります。皮下注射針のハブに挟ま使い捨て5ミリリットルのプラスチック製のピペットは、この解剖のツールに便利なハンドルとして機能します。微細な解剖のピンが同じように作られている方法。シャープステップの後、移動するからそれを防ぐため、小さな切開のピンを解放するために先端からのカットが約3mmように鉗子でしっかりと線の非常に先端をつかみます。の把握からばらまかれているからピンを防ぐために注意して使用鉗子。
フィレットに成人ショウジョウバエの腹部を準備します。
- 胸部も細かい解剖のピンを配置することによって、解剖プレート（ダウコーニングSylgard）にフライを固定します。
- ハエの足と羽を取り外します。足のほとんどの後部セットを除去しつつ、胸部、腹部を満たす場所にちょうど前の時点でキューティクルの開口部を作成します。この開口部は、腹部の腹側表面に沿って切開を行うためのアクセスポイントとして、後で使用されます（ステップ5を参照）
- 生殖器セグメントを介して第解剖のピンを配置することによって、場所のハエの腹部を固定します。
- チルドシールド付きフライをカバーし、M3昆虫培地（Sigma）を歌った。パスツールピペットでそれを描くことで、任意の閉じ込められた空気を削除します。
- 鉗子を使用すると、性器部分に足を除去することによって作成された表皮の開口部から腹側正中線に沿って切開することで腹部を開く。腹部から内臓や生殖腺を削除します。
- 胸部に腹部を接続するキューティクルと気管を切断する。胸部に腹部を結ぶ唯一残っている組織は、心臓にする必要があります。これはいくつかの安定性と腹部キューティクルを提供し、次のステップの間に回転やねじれを防ぐことができます。
- 腹部表皮の前方ほとんど角をフラットピン。胸部を削除します。キューティクルの張りつめた、ピンフラット後部の角キューティクルを引っ張る。性器部分のピンは、キューティクルを平らにするために再配置する必要があります。
パート2。 Oenocyte解剖
腹部フィレット準備は心臓、脂肪体、気管、体壁の筋肉、表皮、およびoenocytesを含む腹部のクチクラと接続されている組織の内部表面を公開します。心臓は、背側正中線に沿って位置しています。脂肪体（不透明な組織）は、内部クチクラ表面のほとんどをカバーしています。気管には（白管状構造）側面換気孔の開口部から延び、そしてこれらの組織に潜入豊富な枝を作る。これらの組織の下に横たわる、色素oenocytes（琥珀色のセル）正中線からの各セグメントの後方領域でのキューティクルの外側縁に放射する。 oenocytesは、それぞれの背板（背側クチクラプレート）の濃い日焼けした地域の直下に位置し、その場所の予備知識がなくても識別が困難になる可能性があります。腹側に位置するoenocytesの別の人口はsternites（腹側クチクラプレート）に関連付けられており、これらの細胞を単離することが可能ですが、このビデオプロトコルは背oenocytesの解剖のデモンストレーションを行います。各腹節では、脂肪体の組織の顕著な葉はoenocytesに前方にある;脂肪体の小さなあまり目立たない葉はoenocytesの後部にあります。脂肪体の組織の顕著な葉は、しばしばoenocyteをカバーその前のセグメントの秒。背脈管と脂肪体はoenocytesを公開するために、最初に削除する必要があります。
色素沈着の強さは年齢とともに増加し、1、明らかに周囲の組織からこれらの細胞を区別する-彼らの名前の派生元oenocytesの琥珀色の色素沈着、（ギリシャ語oînosから、"ワイン"oenoが ）ので注意することが重要です。フライの。また、基底膜は細胞のクラスターへの支援を提供し、解剖時の解離になってから細胞を防止するため、oenocytes 2,3を ensheathes。基底膜は、これらの癒着は容易に中断することができる弱点を作成することによって、そのような脂肪体の組織としてextraneously付着した組織の除去にも役立ちます。
以下に概説する手順は、腹部の外皮からoenocytesを除去する方法について詳しく説明しています。 oenocytesは簡単に腹部のセグメント2-5（オス）、及び2-6（メス）から削除することができます。最初と最後の腹部のセグメント（セグメント1、雌で、雄で6または7）からoenocytesは、しばしば表皮の角を保持している解剖ピンによって破壊されているため、回避されています。 oenocytesの除去は、実行するために約10分かかります。
大人oenocytesを分離するには：
- 解剖針を用いて気門から発せられる気管のトランクを切断する。
- 解剖針でキューティクルの内面への接続を切断することにより脂肪体と心を取り外します。そのためには、脂肪体とoenocytes間解剖針のポイントを置き、そして心臓の下に移動し、反対側を続け、正中線に至るまで、キューティクルの外側縁からドラッグします。前方に後方から進行すると、連続する各セグメントの表皮から脂肪体の組織と心を取り除く。慎重に実行する場合oenocytesがキューティクルに接続されたままになり、脂肪体と心を全体削除することができます。
- キューティクルの内側の表面に体壁の筋肉のストラップはoenocytes。解剖針を使用すると、各セグメントの長手方向の体壁の筋肉を切断する。そのためには、優しくキューティクルの表面からそれらを持ち上げ、oenocyteストランドの後側に沿って切開の針をドラッグします。リボン状のoenocyteストランドはキューティクルから離れて来る必要がありますし、残りのoenocytesが取り外されている間は側に置くことができる。
- 一度キューティクルから削除し、解剖のプレートの上に横たわるそれはoenocytesから脂肪体の組織に付着いずれかをオフきれいにする必要があるかもしれません。これは、単に脂肪体の組織とoenocytesの間で解剖針を配置し、下と解剖のプレートに対して針を押して、接続を切断することによって行われます。
- 単に解剖針の端でそれらを突くことによってoenocyteストランドを収集します。一度oenocytesが培地の表面を横切ってゆっくりと引き出すことができる解剖針の端に貼り付け。解剖oenocytesは、RNAやタンパク質の抽出のいずれかの適切な細胞溶解バッファーに直接配置することができます。シングル男性のフライからoenocytes（腹部セグメント2-5）一般的にトータルRNAの15 - 20ngをもたらすことに注意してください。
図凡例：
図1。 D.のオスとメスoenocytesのデサチュラーゼ遺伝子の発現、desat1とdesatF、キイロ 。成人男性および女性oenocytes由来のcDNAからdesat1とdesatFの逆転写- PCR増幅。 desat1遺伝子は 、男性と女性のoenocytes両方で表されます。desatF式は 、女性oenocytesで排他的に発現されて、性的二形である。遺伝子発現におけるこれらの違いに対応する、desat1は男性と女性の9の両方に共通の炭化水素化合物の製造のために必要であり、desatFは、女性特有の炭化水素化合物10,11の生産に関与している。desatFを特異的に発現されることが示されているin situハイブリダイゼーションの12 のによる女性oenocytesインチ平均してトータルRNAの15 - 20ngは個々のハエから摘出oenocytesから得られることに注意してください。 RNAをRNeasyマイクロキット（Qiagen）を用いて単離され、cDNAがqScript cDND合成キット（QuantaがBiosciences）を用いて製造された
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Discussion
このビデオの記事では、成人D.からoenocytesの調製のための詳細な解剖のプロトコルを提示分子解析に適した方法でキイロ 。解剖の方法の省略されたテキストベースのアカウントは別の場所で2記載されている、との結果oenocyte準備はRNAとタンパク質2の両方の抽出のための適切なことが実証されています。この準備を使用して、それはまた、外植oenocytesの培養方法を開発できる可能性があります。 oenocyte移植片培養のためのプロトコルは、クチクラ炭化水素の化学成分を合成し分泌するこれらの細胞の自律的な代謝能力を決定することを目的とした調査を支援するでしょう。 oenocytesの標的遺伝子操作を可能にする、最近開発されたoenocyte - Gal4の4行目、、との組み合わせでこれらの技術は、大人のショウジョウバエのoenocyte機能の詳細な分子遺伝学的解析が可能になります。
Oenocyte細胞は、両方の幼虫と成体のハエで発見されています。これらの細胞は多くの形態学的および超微細構造の類似性を共有しながら、それは大人のハエのoenocytesは幼虫の段階5で胚発生時に差別化し、存在したものから発展的に異なっていることに注意することが重要です。大人のoenocytesは蛹化時にはde novo形成し、成人の生活7の第1週の間に数が増加し続け、histoblasts 6から派生することが報告されている。大人ミバエのoenocytesがクチクラ炭化水素4の産生に必要とされるが、幼虫のoenocytesは同様の機能をサポートしている場合は決定されていない。同様に、幼虫oenocytesは、脂質代謝、8〜に関して、肝細胞のような機能を維持し、同様の役割はまだ大人のoenocytesのために示されていない。準備は、幼虫と大人oenocytesが機能的に似ている度合いを決定することを目的としている調査を支援するここで示された。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、このビデオの記事の撮影で彼女の援助のためにAmsaleやめるに感謝します。この作業はCIHR、NSERCおよびJDLにCRCの補助金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
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