Summary
곤충에서 oenocytes는 cuticular 탄화 수소 화합물을 생산합니다. 이러한 화합물은 건조로부터 보호하고 화학 커뮤니케이 션을 촉진한다. 여기 우리는 성인에서 oenocytes을 분리하는 데 사용되는 절개 기법을 보여줍니다
Abstract
에
Protocol
1 부. 성인 Drosophila의 복부의 등심 준비.
절차는 아래와 즉각은 oenocytes의 후속 제거 (프로토콜의 파트 참조) 복부를 준비 설명했다. 동일한 절차는 등의 선박 (즉 심장)와 지방 바디를 포함하여 표피의 내부 표면에 부착된 다른 조직의 준비에도 사용할 수 있습니다.
비디오 문서의 oenocyte 절개 기법이 성인 야생 타입 (캔턴 - S) 남성 날아, 나이 여섯 일 증명입니다. 동일한 기술은 여성 파리에서 oenocytes를 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 복부 등심 준비가 수행하는 약 5 분 정도 소요됩니다.
시작하기 전에 준비 몇 가지 미세 절개 핀 (아래 참조 및 파트 2)와 절개의 바늘 (2 부 참조)하는 것이 중요합니다. 상용 해부 핀 및 바늘이 프로토콜을 종종 너무 큰, 그래서 우리가 실험실에서 우리 자신을 fabricating로 이동합니다. 해부 바늘을 만들려면, 텅스텐 와이어는 (0.005 ") 첫번째 피하 바늘의 축 (27G, 알루미늄 허브)를 통해 스레드입니다. 스레드는 와이어가 피하 바늘 끝을 통해 그것이 허브에서 나온다 있도록. 튀어나온 와이어를 크림프 허브에서;. 이것은 피하 바늘에서 철수되는 와이어를 방지 다음, 와이어 여러 mm (~ 3-4mm)은 피하 바늘 끝에서 내다 그 방해 등 반대 끝에 선을 자르 나온다. 불꽃을 통해 노출 텅스텐의 일각은 매우 좋은 지점으로 전선을 선명하게합니다. 피하 바늘의 중심에 쐐기 일회용 5ml 플라스틱 피펫이 해부 도구를위한 편리한 손잡이 역할을합니다. 벌금 해부의 핀이 유사한으로 이루어집니다 방법입니다. 선명 단계 후, 이동에서 그것을 방지하고 작은 절개 핀을 공개하는 팁에서 상처는 약 3mm 수 있도록 단단히 포셉와 와이어의 매우 유용한 정보를 파악가.의 파악에서 떨어져되는 핀을 방지하기 위해주의를 기울이시기 바랍니다 포셉.
필릿하려면 성인 Drosophila의 복부를 준비 :
- 흉부하지만 벌금 해부 핀을 배치하고, 해부 접시 (다우 코닝 - Sylgard)에 파리를 고정합니다.
- 파리의 다리와 날개를 제거합니다. 다리의 가장 뒷부분 집합을 제거하는 동안, 흉부의 복부가 만나는 곳이 단 앞쪽에 시점에서 표피에 개방을 만듭니다. 이 오프닝은 (5 단계 참조) 복부의 복부 표면을 따라 절개를 만들기위한 액세스 포인트로 나중에 사용됩니다
- 성기 세그먼트를 통해 두 번째 절개 핀을 배치 장소에서 비행의 복부를 확보.
- 냉장 쉴드와 함께 비행을 차지하고 있으며 M3 곤충 미디어 (시그마)를 생. 파스퇴르 피펫으로를 드로잉하여 갇혀 공기를 제거합니다.
- 사용 포셉은 성기 세그먼트에 다리를 제거하여 만든 표피에 열 배면의 정중선을 따라 절개하여 복부를 엽니다. 복부의 내장과 생식선을 제거합니다.
- 흉부에 복부를 연결하는 표피와 tracheae을 세버. 흉부에 복부를 연결하는 유일한 나머지 조직은 심장해야합니다. 이것은 몇 가지 안정성과 복부 표피를 제공하고, 다음 단계에서 회전이나 비틀림에서 방지할 수 있습니다.
- 복부 표피의 가장 앞쪽에 모서리를 평평하게 핀. 흉부를 제거합니다. 표피의 긴장, 핀 평판 뒷부분 모서리 표피 이겠지. 성기 부분의 핀은 표피는 평평하다 할 재지정해야 할 수 있습니다.
2 부. Oenocyte 해부
복부 등심 준비는 복부 표피와 심장, 지방 몸, tracheae, 신체 벽의 근육, 표피 및 oenocytes 포함한 첨부된 조직의 내부 표면을 제공합니다. 가슴 지느러미 정중선을 따라 자리잡고 있습니다. 지방 몸 (불투명 조직)는 내부 cuticular 표면의 대부분을 차지하고 있습니다. Tracheae은 (화이트 관형 구조) 측면 공기 구멍 구멍에서 확장하고, 이러한 조직에 침투하여 광범위한 지점을 확인합니다. 색소 oenocytes (호박색 전지) 정중선에서 각 세그먼트의 뒷부분 지역의 표피의 측면 가장자리에 방출,이 티슈 아래 누워. oenocytes 각 tergite (지느러미 cuticular 접시)의 음울하게 빠져있었단 영역 바로 아래에 누워 자신의 위치의 사전 지식없이도 식별하기 어려울 수 있습니다. ventrally 위치 oenocytes 또 다른 인구는 sternites (복부 cuticular 접시)와 관련이 있으며 이러한 세포를 분리 수 있지만,이 비디오 프로토콜은 지느러미 oenocytes의 절개를 보여주는 것입니다. 각 복부 세그먼트에서 지방 신체 조직의 눈에 잘 띄는 나뭇잎이 oenocytes으로 앞쪽에 자리잡고, 지방 기관의 작은 덜 명백한 나뭇잎은 oenocytes로 사후에 자리잡고 있습니다. 지방 신체 조직의 유명 잎은 종종 oenocyte을 커버앞에 세그먼트의 S. 등의 혈관과 지방 시체가 oenocytes을 폭로하기 위해 최초 제거해야합니다.
주의하는 것이 중요합니다 그 이름이 유래하는 oenocytes의 황색 착색 (oeno - 그리스어 oînos에서 '와인') 1, 명확하게 주변 조직에서 이러한 세포를 구분하며 착색의 강도는 나이가 증가 비행 중. 또한, 기초 라미나는 셀 클러스터 지원을 제공하고 해부하는 동안 dissociated되는에서 세포를 방지, oenocytes 2,3를 ensheathes. 기초 라미나 또한이 adhesions 쉽게 중단될 수있는 약점을 생성하여, 그러한 지방 신체 조직으로 extraneously 준수 조직의 제거에 에이즈.
아래에 설명된 절차는 복부 외피에서 oenocytes의 제거에 대한 자세한 지침을 제공합니다. oenocytes 쉽게 복부 세그먼트 2-5 (남), 그리고 2-6 (암)에서 제거할 수 있습니다. 처음이자 마지막 복부 세그먼트 (세그먼트 1, 남성의 6 암컷 7)에서 oenocytes은 종종 표피의 모서리를 가지고있는 해부 핀에 의해 방해하고 따라서 피할 수 있습니다. oenocytes의 제거가 수행하는 약 10 분 정도 소요됩니다.
성인 oenocytes을 분리하려면 다음 단계를 따르십시오
- 해부 바늘을 사용하여 spiracles에서 냄새가 나는데 tracheal 줄기를 세버.
- 해부의 바늘로 표피의 내부 표면에 연결을 severing하여 지방 몸과 마음을 제거합니다. 이렇게하려면, 지방 신체 oenocytes 사이의 해부 바늘의 지점을 위치하고, 심장 아래에 이동하고, 반대편 계속, 정중선을 통해 표피의 측면 가장자리에서 드래그합니다. 앞쪽이 뒷부분에서 진행하는 것은, 각 연속 구간의 표피에서 지방 신체 조직과 마음을 제거합니다. 신중하게 수행한 경우 oenocytes은 표피에 부착된 유지하고, 지방 몸과 마음 전체를 제거할 수 있습니다.
- 표피의 내부 표면에 바디 벽 근육 스트랩은 oenocytes. 해부 바늘을 사용하면 각 세그먼트의 길이 본문 벽의 근육을 끊는. 이렇게하려면, 부드럽게 표피의 표면에서 그들을 올려서, oenocyte 스트랜드의 후부 측면을 따라 절개 바늘을 끕니다. 리본 같은 oenocyte 털들은 표피 가까이 와서해야하며 나머지 oenocytes가 제거하는 동안 길가에 마련하실 수 있습니다.
- 일단 표피에서 제거하고 해부 접시에 누워있는 것은 그것은 닦아해야 할 수있는 oenocytes에서 지방 신체 조직을 준수. 이것은 단순히 지방 신체 조직과 oenocytes 사이의 해부 바늘을 삽입하고, 아래와 절개 판에 대한 바늘을 밀어 연결을 severing 통해 이루어집니다.
- 단순히 해부 바늘의 끝에 그들을 파고하여 oenocyte 가닥를 수집합니다. 일단 oenocytes이 문화 매체의 표면에 걸쳐 천천히 뽑아 수있는 해부 바늘의 끝에 붙어. 해부 oenocytes는 RNA 또는 단백질 추출 중 적합한 세포 용해 버퍼에 직접 삽입할 수 있습니다. 한 남자의 비행에서 oenocytes (복부 세그먼트 2-5)는 일반적으로 총 RNA 15 - 20ng을 산출 것을. 참고
그림 범례 :
그림 1. D.의 남성과 여성 oenocytes의 desaturase 유전자, desat1 및 desatF의 표현 melanogaster. 성인 남성과 여성의 oenocytes에서 추출한 cDNA에서 desat1 및 desatF의 역방향 전사 - PCR의 증폭. desat1 유전자가 남성과 여성의 oenocytes 모두 표시되며 desatF 표현은 여성 oenocytes에 독점적으로 표현되고, 성적으로 동종 이형의입니다. 유전자 발현에 이러한 차이에 대응하는, desat1은 남성과 여성 구 모두에게 공통의 탄화 수소 화합물의 생산에 필요한이며, desatF는 여성 고유의 탄화 수소 화합물 10,11의 생산에 관여합니다. desatF은 특히 표현으로 표시되었습니다 현장 하이브리드화 12에 의해 여성 oenocytes 인치 평균 총 RNA 15 - 20ng가 개인 비행기에서 해부 oenocytes에서 얻은입니다. RNA는 RNeasy 마이크로 키트 (Qiagen)를 사용하여 격리되었다; cDNA는 qScript cDND 합성 키트 (콴타 BioSciences)을 사용하여 제작되었습니다
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Discussion
이 동영상이 문서에서 우리는 성인에서 oenocytes의 준비에 대한 자세한 해부 프로토콜을 제시 D. 분자 분석을 위해 적합한 방식으로 melanogaster. 간략 텍스트 기반의 계정 절개 방법의 대부분은 다른이 설명되었고, 그 결과 oenocyte 준비는 RNA와 단백질이 모두의 추출에 적합한 것으로 증명되었습니다. 이 준비를 사용하여 그것은 또한 explanted oenocytes의 culturing에 대한 방법을 개발하는 수도 있습니다. oenocyte explant 문화에 대한 프로토콜 cuticular 탄화 수소의 화학 성분을 합성하고 분비 이러한 세포의 자치 대사 용량을 결정하기위한 조사를 지원합니다. oenocytes의 타겟 유전자 조작을 허용하는 최근 개발 oenocyte - Gal4 라인 4,,와 함께이 기술은 성인 과일 파리에서 oenocyte 기능의 상세한 분자 유전 분석을 위해 수 있습니다.
Oenocyte 세포는 모두 유충과 성인 비행에서 발견됩니다. 이러한 세포는 많은 형태학의 및 ultrastructural 유사성을 공유하는 동안, 그것은 성인 비행의 oenocytes가 애벌레 단계 5 중 배아 발달 동안 차별과 존재한다는과는 별개의 발달됩니다하는 것이 중요합니다. 성인 oenocytes는 pupation 동안 드 노보을 형성하고 성인 생활 7 첫 주 동안 수가 증가 지속, histoblasts 6 파생된 것으로보고되었습니다. 성인 과일 파리의 oenocytes가 cuticular 탄화 수소 4의 생산에 필요한 있지만, 그것은 애벌레 oenocytes가 유사한 기능을 지원하는 경우 결정으로 남아 있습니다. 마찬가지로, 애벌레 oenocytes는 지질 대사 8 관한 hepatocyte 같은 기능을 유지하고, 유사한 역할은 아직 성인의 oenocytes에 표시되지 않았습니다. 준비는 애벌레와 어른 oenocytes이 기능 유사 정도를 결정하기위한 아르 조사를 지원합니다 여기에 보여주었다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 비디오 문서의 촬영에서 그녀의 도움을 Amsale 잠시 거기서 가만히 감사하고 싶습니다. 이 작품은 CIHR, NSERC과 JDL하는 CRC의 보조금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
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