Summary
Em insetos, o oenocytes produzir compostos de hidrocarbonetos cuticulares. Estes compostos protegem contra a dessecação e facilitar a comunicação química. Aqui nós demonstramos uma técnica de dissecção usado para isolar o oenocytes de adultos
Abstract
Em
Protocol
Parte 1. Preparação filé do abdômen Drosophila adulto.
O procedimento descrito abaixo imediata prepara o abdômen para a posterior remoção da oenocytes (ver Part2 de protocolo). O mesmo procedimento também pode ser usado para a preparação de outros tecidos ligados à superfície interna da cutícula, incluindo o vaso dorsal (isto é, o coração) e gordura corporal.
Note que no artigo de vídeo a técnica de dissecação oenocyte é demonstrado em um adulto de tipo selvagem voar (Canton-S) do sexo masculino, seis dias de idade. Técnicas idênticas podem ser usados para remover o oenocytes de moscas fêmeas. A preparação filé abdômen leva aproximadamente 5 minutos para executar.
Antes de começar é importante ter em mãos vários pinos de dissecção fina (ver abaixo e Parte 2) e uma agulha de dissecção (ver Parte 2). Pinos dissecção disponíveis comercialmente e agulhas são muitas vezes demasiado grandes para este protocolo, por isso temos levado para fabricar nosso próprio laboratório. Para criar a agulha de dissecação fio de tungstênio, (0,005 ") é a primeira enfiada através do eixo da agulha hipodérmica (27G, alumínio hub). Passe o fio através da ponta da agulha hipodérmica para que emerge do hub. Crimp o fio salientes de hub;. isso impede que o fio seja puxado para fora da agulha hipodérmica Em seguida, corte o fio na extremidade oposta do tal de cravar que vários milímetros (~ 3-4mm) de fio se projetam a partir da ponta da agulha hipodérmica Passing. a ponta de tungstênio exposta através de uma chama irá aguçar o fio a um ponto muito bem. Uma pipeta de plástico descartáveis 5ml, quando preso no cubo da agulha hipodérmica atua como lidar com esta ferramenta conveniente para dissecção. Os pinos dissecção fina são feitas de forma semelhante caminho. Após a etapa de nitidez, segure a ponta do fio firmemente com uma pinça para evitar que se mova e fazer um corte de aproximadamente 3mm da ponta para liberar o pino de dissecção de pequeno porte. Tome cuidado para evitar que o pino de ser lançados a partir da compreensão da a pinça.
Para preparar o filé de abdômen Drosophila adulto:
- Assegurar a voar para a placa de dissecção (Sylgard; Dow-Corning), colocando um pino dissecção fina que o tórax.
- Remove as pernas e as asas da mosca. Ao remover o conjunto mais posterior das pernas, criar uma abertura na cutícula no ponto anterior apenas para onde o tórax do abdômen encontra. Esta abertura é usado posteriormente como um ponto de acesso para fazer uma incisão ao longo da superfície ventral do abdome (ver Etapa 5)
- Garantir o abdômen da mosca no lugar, colocando um pino dissecção segundo através do segmento genital.
- Cobrir a voar com Shields refrigerados e Sang inseto M3 médio (Sigma). Remover o ar, chamando-a com uma pipeta Pasteur.
- Forceps usando abrir o abdómen, fazendo uma incisão ao longo da linha mediana ventral desde a abertura na cutícula criado por eliminar as pernas para o segmento genital. Retire as tripas e gônadas do abdômen.
- Sever a cutícula e traquéias de ligar o abdômen para o tórax. O tecido único remanescente de ligar o abdômen para o tórax deve ser o coração. Isto proporciona a cutícula abdominal com alguma estabilidade, e impede que esta rotação ou torção durante a próxima etapa.
- Pin plano da anterior maioria dos cantos da cutícula abdominal. Remover o tórax. Puxando a cutícula tenso, pin flat os cantos posterior da cutícula. O pino no segmento genital pode precisar ser reposicionado para fazer a cutícula colocar o plano.
Parte 2. Dissecção Oenocyte
A preparação filé abdômen expõe a superfície interna da cutícula abdominal e tecidos em anexo, incluindo o coração, gordura corporal, traquéia, músculos da parede do corpo, a epiderme, e os oenocytes. O coração fica ao longo da linha média dorsal. De gordura corporal (tecido opaco) cobre a maior parte da superfície interna cuticular. Traquéias (branco estruturas tubulares) se estendem desde as aberturas espiráculo lateral, e fazer ramos extensos que se infiltram nesses tecidos. Deitado debaixo destes tecidos, o oenocytes pigmentadas (de cor âmbar células) irradiam a partir da linha média para a borda lateral da cutícula na região posterior de cada segmento. O oenocytes estão diretamente sob o bronzeado regiões de cada tergito (dorsal placas cuticular) e pode ser difícil identificar, sem conhecimento prévio da sua localização. Outra população de oenocytes ventralmente localizada está associada com a sternites (ventral placas cuticular), embora seja possível isolar estas células, este protocolo de vídeo só vai demonstrar a dissecção da oenocytes dorsal. Em cada segmento abdominal, uma folha de destaque de tecido de gordura corporal está anterior à oenocytes; uma pequena folha menos óbvias de gordura corporal encontra-se posterior ao oenocytes. A folha de destaque de tecido de gordura corporal, muitas vezes cobre a oenocytes do segmento precedente. O vaso dorsal e de gordura corporal deve ser removido no primeiro fim de expor o oenocytes.
É importante notar que a pigmentação amarela da oenocytes, da qual deriva o nome de seu (Oeno - do grego oinos, "vinho") 1, distingue claramente estas células dos tecidos circundantes, a intensidade da pigmentação aumenta com a idade da mosca. Além disso, uma lâmina basal ensheathes a 2,3 oenocytes, dando suporte aos grupos de células e prevenindo que as células se tornem dissociada durante a dissecção. A lâmina basal também ajuda na remoção de tecidos extraneously aderido, como o tecido de gordura corporal, através da criação de um ponto fraco, onde estas aderências pode ser facilmente rompido.
O procedimento descrito a seguir fornece instruções detalhadas para a remoção do oenocytes do tegumento abdominal. O oenocytes pode ser facilmente removido segmentos abdominais 2-5 (masculino) e 06/02 (feminino). O oenocytes do primeiro e último segmentos abdominal (segmentos 1 e 6 do sexo masculino ou 7 no feminino) são muitas vezes interrompidas pelos pinos dissecção segurando os cantos da cutícula e são, portanto, evitado. A remoção do oenocytes leva aproximadamente 10 minutos para executar.
Para isolar o oenocytes adulto:
- Sever do tronco traqueal que emana do espiráculos usando uma agulha de dissecção.
- Remover a gordura corporal e do coração, cortando as ligações à superfície interna da cutícula com uma agulha de dissecção. Para isso, posicione o ponto da agulha dissecção entre a gordura corporal ea oenocytes, e arrastá-lo a partir da borda lateral da cutícula, através da linha média, passando por baixo do coração, e continuando para o lado oposto. Progredindo do posterior ao anterior, remover o tecido de gordura corporal e do coração da cutícula de cada segmento sucessivo. Se realizada com cuidado o oenocytes permanecer solidários com a cutícula, ea gordura corporal e do coração pode ser removido todo.
- Corpo de parede tira os músculos do oenocytes à superfície interna da cutícula. Utilizando a agulha de dissecção romper os músculos do corpo longitudinal parede de cada segmento. Para fazer isso, arraste a agulha de dissecção ao longo do lado posterior da vertente oenocyte, levantando-os suavemente a partir da superfície da cutícula. Os fios fita-como oenocyte deve vir longe da cutícula e podem ser estabelecidas para o lado enquanto o oenocytes restantes são removidos.
- Uma vez retirado da cutícula e deitado na placa de dissecação, pode ser necessário para limpar qualquer aderido ao tecido de gordura corporal a partir do oenocytes. Isto é feito simplesmente colocando a agulha de dissecção entre o tecido de gordura corporal ea oenocytes, e cortando a ligação, empurrando a agulha para baixo e contra a placa de dissecação.
- Recolher os fios oenocyte simplesmente cutucando-os com a ponta da agulha de dissecção. Uma vez preso à extremidade da agulha de dissecação do oenocytes pode ser puxado lentamente em toda a superfície do meio de cultura. O oenocytes dissecados pode ser colocado diretamente em tampão de lise celular apropriado para tanto RNA ou extração de proteínas. Note que o oenocytes (segmentos abdominais 2-5) a partir de uma mosca macho normalmente produz 15 20ng de RNA total.
Figura Legenda:
Figura 1. Expressão dos genes desaturase, desat1 e desatF, em oenocytes macho e fêmea de D. melanogaster. amplificação de transcrição reversa-PCR de desat1 e desatF de cDNA derivado de adultos oenocytes masculino e feminino. O gene é expresso em desat1 oenocytes tanto masculino e feminino; expressão desatF é sexualmente dimórfico, sendo expresso exclusivamente em oenocytes feminino. Correspondentes a estas diferenças na expressão gênica, desat1 é necessária para a produção de compostos de hidrocarbonetos comuns a ambos os homens e mulheres 9, e desatF está envolvido na produção de compostos de hidrocarbonetos especificamente feminino 10,11. DesatF foi mostrado para ser especificamente expressos em oenocytes feminino por em 12 de hibridização in situ. Note-se que, em média, 15 20ng de RNA total é obtido a partir da oenocytes dissecada a partir de uma mosca individual. RNA foi isolado usando o micro RNeasy kit (Qiagen); cDNA foi produzido usando o qScript síntese cDND kit (Quanta BioSciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste artigo de vídeo apresenta um protocolo de dissecação detalhada para a preparação do oenocytes do adulto D. melanogaster de forma adequada para a análise molecular. Um texto baseado em abreviado em conta o método de dissecação tem sido descrito em outros lugares 2, ea preparação resultando oenocyte demonstrou ser adequado para a extração de RNA e proteínas 2. Usando essa preparação também pode ser possível desenvolver métodos para a cultura de oenocytes explantado. Um protocolo para uma cultura de explantes oenocyte ajudaria investigações tendentes a determinar a capacidade autónoma metabólica destas células para sintetizar e secretar os constituintes químicos de hidrocarbonetos cuticulares. Estas técnicas em combinação com um recentemente desenvolvido line oenocyte Gal4-4, que permite a manipulação genética do alvo oenocytes, permitirá a análise molecular detalhada da função genética oenocyte na mosca da fruta adulto.
Oenocyte células são encontradas tanto na larva e da mosca adulta. Embora essas células compartilham muitas semelhanças morfológicas e ultra-estruturais, é importante notar que o oenocytes da mosca adulta são developmentally distintas daquelas que diferenciam durante o desenvolvimento embrionário e existem durante as fases larval 5. O oenocytes adultos foram relatados para ser derivado do 6 histoblasts, formando de novo durante a pupação e continua a aumentar em número durante a primeira semana de vida adulta 7. Enquanto o oenocytes da mosca adulta são necessários para a produção de hidrocarbonetos cuticulares 4, ainda não se determinou se oenocytes larval suporte uma função similar. Da mesma forma, oenocytes larval manter hepatócito funções semelhantes no que diz respeito ao metabolismo lipídico 8; um papel semelhante ainda não foi mostrado para o oenocytes do adulto. A preparação será demonstrado aqui as investigações que visam determinar o grau em que o oenocytes larvas e adultos são funcionalmente semelhantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Amsale Belay por sua ajuda nas filmagens deste artigo vídeo. Este trabalho foi financiado pela CIHR, NSERC e subvenções para CRC JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
