Summary
У насекомых, oenocytes производить кутикулярных углеводородных соединений. Эти соединения защищают от высыхания и способствовать химической связи. Здесь мы показываем, рассечение техника, используемая для изоляции от взрослых oenocytes
Abstract
В
Protocol
Часть 1. Филе подготовки взрослых живота дрозофилы.
Процедуры, описанной ниже, немедленно готовит живота для последующего удаления oenocytes (см. Часть 2 протокола). Аналогичная процедура может также использоваться для подготовки других тканей придает внутренней поверхности кутикулы, в том числе спинного сосуда (т.е. сердца) и жира в организме.
Отметим, что в видео статья oenocyte технику вскрытия демонстрируется на взрослого дикого типа (Canton-S) мужчина летать, шесть дней от роду. Одинаковые методы могут использоваться для удаления oenocytes от самок. Подготовка живота филе занимает около 5 минут, чтобы выполнить.
Перед тем как начать, важно иметь наготове несколько прекрасных контакты вскрытия (см. ниже и Часть 2) и рассечение иглы (см. часть 2). Коммерчески доступные рассечение иголках зачастую слишком велики для этого протокола, поэтому мы приняли для изготовления наших в лаборатории. Чтобы создать вскрытия иглой, вольфрамовой проволоки (0,005 ") сначала пропускаются через вал подкожные иглы (27G, алюминиевый концентратор). Пропустите проволоку через кончик шприц так, чтобы она выходит из хаба. Обжимные проволокой выступающие от центра;. это мешает провод от вытащил из шприц Затем разрезать провод на противоположный конец обжимной, что несколько миллиметров (~ 3-4мм) провода торчат из кончика шприц Проходя. кончик подвергается вольфрама через пламя будет точить провод очень тонкий момент. одноразовой пластиковой пипеткой 5 мл, когда вклинивается в центр шприц выступает в качестве удобной ручкой для этого рассечение инструмент. штраф контакты рассечение производится в аналогичной образом. После заточки шаг, держитесь самый кончик проволоки прочно щипцами, чтобы предотвратить его перемещение и сделать разрез приблизительно 3 мм от кончика к выпуску булавки рассечение. Будьте осторожны, чтобы предотвратить вывод от того, бросил из рук щипцов.
Чтобы подготовить филе взрослых живота дрозофилы:
- Безопасные лететь в рассечение пластины (Sylgard; Dow-Corning), поместив тонкий контактный вскрытия хотя грудной клетки.
- Удалить ножки и крылья летать. В процессе удаления самых задних набор ног, создают отверстия в кутикуле в точке только впереди, где встречается грудной клетки живота. Это открытие дальнейшем использован в качестве точки доступа для создания разреза вдоль вентральной поверхности живота (см. шаг 5)
- Безопасные живота летать на месте, поставив второй контактный рассечение через генитальный сегмент.
- Обложка летать с охлажденной Шилдс и Санг M3 насекомых среде (Sigma). Удалите пузырьки воздуха, нарисовав его с пипетки Пастера.
- Использование щипцов открытым живот, сделав надрез вдоль вентральной срединной линии из отверстия в кутикуле создан путем удаления ноги генитальный сегмент. Удалить кишки и половых желез от живота.
- Север кутикулу и трахеи подключения живота, чтобы грудная клетка. Единственный оставшийся ткани подключения живота, чтобы грудная клетка должна быть сердце. Это обеспечивает брюшной кутикулы с некоторой стабильности, и защищает его от поворота или скручивания во время следующего шага.
- Pin плоской передней всех уголках брюшной кутикулы. Удаление грудной клетки. Тяговая кутикулы тугой, контактный плоский задний углы кутикулы. Штифт в генитального сегмента, возможно, должны быть повторно сделать кутикулу лежать.
Часть 2. Oenocyte рассечение
Подготовка живота филе разоблачает внутреннюю поверхность брюшной кутикулы и придает тканей, включая сердце, жира, трахеи, мышцах стенки тела, эпидермис, и oenocytes. Сердце лежит вдоль спинной средней линии. Жир тела (непрозрачная ткань) покрывает большую часть внутренней поверхности кутикулярной. Трахеи (белые трубчатые структуры) простираются от боковых отверстий дыхало, а также широко ветви, которые проникают этих тканях. Лежа под этими тканями, пигментированные oenocytes (янтарный клеток) исходят от средней линии к боковому краю кутикулы в задней части каждого сегмента. Oenocytes лежат прямо под темной загорелой регионах каждой брюшка (спинной кутикулярных пластинок) и может быть трудно определить без предварительных знаний от их местонахождения. Другая популяция расположена вентрально oenocytes связано с стерниты (вентральная кутикулярные пластин), хотя можно выделить эти клетки, это видео протокол будет только продемонстрировать рассечение спинного oenocytes. В каждом брюшном сегменте, видный лист жировой ткани тела расположена впереди oenocytes; меньшие менее очевидно лист жира тело лежит кзади от oenocytes. Видные лист жировой ткани тела часто охватывает oenocyteе годы сегмент перед ним. Спинной сосуд и жира в организме должно быть удалено первым, чтобы разоблачить oenocytes.
Важно отметить, что янтарь пигментации oenocytes, из которой происходит их название (Оэно - от греческого ойнос, "вино") 1, четко различает эти клетки из окружающих тканей; интенсивность пигментации увеличивается с возрастом в лету. Более того, базальной пластинки ensheathes oenocytes 2,3, оказывая поддержку ячейки кластеров и предотвращения клетки становятся диссоциированных во время вскрытия. Базальной пластинки также способствует удалению extraneously придерживался тканей, таких как жировой ткани тела, создавая слабое место, где эти спайки могут быть легко разрушены.
Процедуры, описанной ниже приведены подробные инструкции по удалению oenocytes из брюшной оболочкой. Oenocytes могут быть легко удалены из брюшной сегменты 2-5 (мужчины) и 2-6 (самки). Oenocytes из первых и последних брюшных сегментов (сегменты 1 и 6 у мужчин и 7 у женщин) часто нарушается рассечение контакты проведения углах кутикулы и, следовательно, избежать. Удаление oenocytes занимает около 10 минут для выполнения.
Чтобы изолировать взрослых oenocytes:
- Север трахеи стволы, исходящих из дыхальца использованием вскрытия иглой.
- Удаление жира в организме и сердца, разрыв соединения с внутренней поверхности кутикулы с рассечение иглы. Чтобы сделать это, положение точки вскрытия иглу между жира в организме и oenocytes, и перетащите его из бокового края кутикулы, до средней линии, двигаясь под сердцем, и продолжает противоположной стороны. Бегущие от задних к передним, удалить жировые ткани тела и сердца от кутикулы каждого последующего сегмента. Если выполнены тщательно oenocytes остаются прикрепленными к кутикулы, и жира в организме и сердце может быть удален целом.
- Стенка тела мышцы ремень oenocytes к внутренней поверхности кутикулы. Использование вскрытия иглой разорвать продольные стенки тела мышцы каждого сегмента. Для этого перетащите вскрытия иглой по задней стороне oenocyte пряди, нежно поднимая их с поверхности эпидермиса. Ленточных oenocyte нити должны прийти от кутикулы и могут быть проложены в стороне в то время как остальные oenocytes удаляются.
- После извлечения из кутикулы и, лежа на вскрытии пластины может быть необходимо очистить от любого придерживался жировой ткани тела от oenocytes. Это можно сделать, просто поместив рассечение иглу между жировой ткани тела и oenocytes, и разрыв связи, нажав на иглу и против вскрытии пластины.
- Соберите oenocyte нити просто тыкая их с конца вскрытия иглой. После прилипла к концу вскрытия иглой oenocytes можно вытянуть медленно по поверхности питательной среды. Расчлененный oenocytes могут быть размещены непосредственно в лизиса клеток буфера подходит для любой РНК или белка добычи. Обратите внимание, что oenocytes (брюшные сегменты 2-5) от одного мужчины летают обычно дает 15-20ng от общего числа РНК.
Рис Легенда:
Рисунок 1. Экспрессия генов десатуразу, desat1 и desatF, в мужской и женской oenocytes Д. MELANOGASTER. обратной транскрипции-ПЦР-амплификации desat1 и desatF из кДНК производным от взрослых мужчин и женщин oenocytes. Ген desat1 выражается и в мужских и женских oenocytes; desatF выражение половой диморфизм, выражается исключительно в женских oenocytes. В соответствии с этими различиями в экспрессии генов, desat1 требуется для производства углеводородных соединений, общих для обоих мужчин и женщин 9 и desatF занимается производством женской конкретных углеводородных соединений 10,11. DesatF было показано, что конкретно выражается в женских oenocytes на на месте 12 гибридизации. Обратите внимание, что в среднем 15-20ng общей РНК получают из oenocytes расчлененное из отдельных летать. РНК выделяли с помощью микро RNeasy комплект (Qiagen); кДНК, полученные с использованием QScript cDND синтеза комплект (Quanta BioSciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео статье мы представляем подробный протокол вскрытия для подготовки oenocytes от взрослых D. MELANOGASTER в порядке, подходящем для молекулярного анализа. Сокращенные текстовые счет вскрытия метод был описан в другом месте 2, и в результате oenocyte Препарат был продемонстрировано, что подходит для извлечения как РНК и белка 2. С помощью этого препарата возможно также разработать методы культивирования эксплантированных oenocytes. Протокол для oenocyte культуры эксплантов помогло бы расследование с целью определения автономного метаболического потенциала этих клеток синтезируют и секретируют химические компоненты кутикулы углеводородов. Эти методы в сочетании с недавно разработанной oenocyte-Gal4 строке 4, что позволяет целевые генетические манипуляции oenocytes, позволит подробная молекулярно-генетического анализа oenocyte функции во взрослой плодовой мухи.
Oenocyte клетки находятся как в личинки и взрослые мухи. Хотя эти клетки имеют много общих морфологических и ультраструктурных сходства, важно отметить, что oenocytes из взрослых мухи умственно отличаются от тех, которые отличают во время эмбрионального развития и существуют в течение личиночной стадии 5. Взрослый oenocytes, как сообщается, будут получены в результате histoblasts 6, образуя заново во время окукливания и продолжает расти число в течение первой недели взрослой жизни 7. Хотя oenocytes из взрослых плодовых мух, необходимых для производства кутикулярной углеводородов 4, еще предстоит определить, если личиночные oenocytes поддержки подобную функцию. Кроме того, личиночной oenocytes поддерживать гепатоцитов-подобные функции в отношении липидного обмена 8; аналогичную роль до сих пор не было показано для oenocytes от взрослого. Подготовку продемонстрировали здесь помогут исследования, которые направлены на определение степени, в которой личинок и взрослых oenocytes функционально схожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Amsale страховки за ее помощь в съемках этого видео статьи. Эта работа финансировалась CIHR, NSERC и КПР гранты ЛЗЕ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
