Summary
En los insectos, el oenocytes producir compuestos cuticulares de hidrocarburos. Estos compuestos protegen contra la desecación y facilitar la comunicación química. Aquí se demuestra una técnica de disección para aislar el oenocytes de los adultos
Abstract
En
Protocol
Parte 1. Preparación de filete de la población adulta del abdomen de Drosophila.
El procedimiento que se describe a continuación inmediata prepara el abdomen de la posterior retirada de la oenocytes (ver Parte 2 del protocolo). El mismo procedimiento se puede utilizar para la preparación de los tejidos que están conectados a la superficie interna de la cutícula, incluyendo el vaso dorsal (es decir, del corazón) y la grasa corporal.
Tenga en cuenta que en el artículo de vídeo de la técnica de disección oenocyte se demuestra en un adulto de tipo salvaje (Cantón-S) mosca macho, de seis días de edad. Técnicas idénticas se puede utilizar para quitar el oenocytes de las moscas hembras. La preparación de filete abdomen tarda aproximadamente 5 minutos para llevar a cabo.
Antes de comenzar es importante tener a mano varios pines disección fina (ver más abajo y Parte 2) y una aguja de disección (véase la Parte 2). Pines disección disponibles en el mercado y las agujas son a menudo demasiado grandes para este protocolo, por lo que hemos tomado para fabricar nuestro propio laboratorio. Para crear la aguja de disección, de alambre de tungsteno (0.005 ") es el primero pasa a través del eje de la aguja hipodérmica (27G, aluminio hub). Pase el cable a través de la punta de la aguja hipodérmica para que emerge desde el centro. Unir el hilo salientes desde el centro;. esto evita que el cable se salga de la aguja hipodérmica A continuación, cortar el alambre en el extremo opuesto de la que como engarce de varios milímetros (~ 3 a 4 mm) de cable sobresalga de la punta de la aguja hipodérmica pasar. la punta de tungsteno expuestos a través de una llama afinar el cable a un punto muy bien. Una pipeta de 5 ml de plástico desechable cuando incrustado en el centro de la aguja hipodérmica actúa como manejar esta herramienta conveniente para la disección. Los pasadores de la disección fina se realizan en una situación similar manera. Después del paso de afilar, agarrar la punta del cable firmemente con unas pinzas para evitar que se mueva y haga un corte de aproximadamente 3 mm de la punta para liberar el pin pequeña disección. Tenga cuidado para evitar pin de ser arrojado del poder de las pinzas.
De filete de preparar el abdomen adulto de Drosophila:
- Asegurar la marcha a la plancha de disección (Sylgard, Dow-Corning) mediante la colocación de un perno de la disección bien, aunque el tórax.
- Quitar las patas y las alas de la mosca. Mientras se quita el conjunto más posterior de las piernas, crear una abertura en la cutícula en el momento justo anterior a donde se reúne el tórax del abdomen. Esta apertura se utiliza después como un punto de acceso para realizar una incisión a lo largo de la superficie ventral del abdomen (ver paso 5)
- Asegurar el abdomen de la mosca en su lugar mediante la colocación de un perno de la disección de segundo a través del segmento genital.
- Cubrir la marcha con escudos refrigerados y Sang M3 medio de insectos (Sigma). Eliminar el aire atrapado por su elaboración con una pipeta Pasteur.
- Utilizando unas pinzas para abrir el abdomen mediante una incisión a lo largo de la línea media ventral de la abertura de la cutícula creado por la eliminación de las piernas para el segmento genital. Retire las vísceras y las gónadas del abdomen.
- Cortar la cutícula y la tráquea que conecta el abdomen al tórax. El único tejido que conecta el resto de abdomen al tórax debe ser el corazón. Esto proporciona la cutícula del abdomen con una cierta estabilidad, y evita que gire o girar en el siguiente paso.
- Patas planas la anterior mayoría de los rincones de la cutícula abdominal. Quitar el tórax. Tirando de la cutícula tensa, pines planos de las esquinas posteriores de la cutícula. El pasador en el segmento genital puede ser necesario volver a colocar para que la cutícula quede plano.
Parte 2. Disección Oenocyte
La preparación de filete abdomen expone la superficie interna de la cutícula del abdomen y los tejidos fijos, incluyendo el corazón, la grasa corporal, tráquea, músculos de la pared del cuerpo, la epidermis y la oenocytes. El corazón se encuentra a lo largo de la línea media dorsal. De grasa corporal (tejido opaco) cubre la mayor parte de la superficie cuticular interna. Tráqueas (blanco estructuras tubulares) se extienden desde las aberturas espiráculo lateral, y que las ramas extensas que se infiltran en los tejidos. Que yace bajo estos tejidos, el oenocytes pigmentada (de color ámbar, las células) se irradian desde la línea media hasta el borde lateral de la cutícula en la región posterior de cada segmento. El oenocytes encuentran directamente bajo la oscura curtida regiones de cada terguito (dorsal placas cuticulares) y pueden ser difíciles de identificar sin un conocimiento previo de su localización. Otra población de oenocytes ventralmente encuentra está asociado con el esternitos (ventral placas cuticulares), a pesar de que es posible aislar estas células, este protocolo de vídeo sólo demostrar la disección de la oenocytes dorsal. En cada segmento abdominal, una hoja destacada de tejido de grasa corporal se encuentra por delante de la oenocytes, una hoja más pequeña menos obvios de la grasa corporal se encuentra por detrás de la oenocytes. La hoja prominentes de tejido de grasa corporal a menudo cubre la oenocytes del segmento que lo precede. El vaso dorsal y la grasa corporal se debe quitar en primer lugar para exponer la oenocytes.
Es importante señalar que la pigmentación de color ámbar de la oenocytes, de la que deriva su nombre (eno - del griego oinos, «vino») 1, distingue claramente estas células de los tejidos circundantes, la intensidad de la pigmentación aumenta con la edad de la mosca. Por otra parte, una lámina basal ensheathes el 2,3 oenocytes, proporcionando apoyo a los grupos de células y la prevención de las células se conviertan en disociada durante la disección. La lámina basal también ayuda en la eliminación de los tejidos extraneously adherido, como el tejido de grasa corporal, mediante la creación de un punto débil en estas adherencias pueden ser fácilmente alteradas.
El procedimiento descrito a continuación se proporcionan instrucciones detalladas para la retirada de la oenocytes del tegumento abdominal. El oenocytes se puede quitar fácilmente de los segmentos abdominales 2-5 (varones) y 2-6 (femenino). El oenocytes de los segmentos abdominales primero y el último (segmentos 1 y 6 en hombres y 7 en mujeres) son a menudo interrumpido por los pasadores de la disección de la celebración de las esquinas de la cutícula y por lo tanto, se evitan. La eliminación de la oenocytes tarda aproximadamente 10 minutos para llevar a cabo.
Para aislar el oenocytes adultos:
- Sever los troncos traqueales que emanan de los espiráculos utilizando una aguja de disección.
- Retire la grasa en el cuerpo y el corazón por la ruptura de las conexiones a la superficie interna de la cutícula con una aguja de disección. Para ello, la posición de la punta de la aguja de disección entre la grasa corporal y la oenocytes, y se arrastra desde el borde lateral de la cutícula, a través de la línea media, pasando por debajo del corazón, y continuando hacia el lado opuesto. Progresando desde el posterior a anterior, retirar el tejido de grasa corporal y el corazón de la cutícula de cada segmento sucesivo. Si se realiza con cuidado el oenocytes permanecer unidos a la cutícula, y la grasa en el cuerpo y el corazón se puede quitar todo.
- Los músculos de la pared del cuerpo de la correa de oenocytes a la superficie interna de la cutícula. Con la aguja de disección de cortar los músculos del cuerpo longitudinal de la pared de cada segmento. Para ello, arrastre la aguja de disección a lo largo de la parte posterior de la cadena oenocyte, suavemente levantar de la superficie de la cutícula. Las hebras oenocyte de cinta debe salir de la cutícula y se puede colocar a un lado mientras que el resto de oenocytes se eliminan.
- Una vez retirado de la cutícula y la mentira en la placa de la disección puede ser necesario para limpiar cualquier adherido a los tejidos de grasa corporal de la oenocytes. Esto se hace simplemente colocando la aguja de disección entre el tejido de grasa corporal y oenocytes, y cortar la conexión al empujar la aguja hacia abajo y contra la placa de disección.
- Reúne los hilos oenocyte con sólo meter la punta de la aguja de disección. Una vez pegado a la punta de la aguja de disección de la oenocytes se puede tirar lentamente a través de la superficie del medio de cultivo. El oenocytes disecados se pueden colocar directamente en el buffer de lisis celular apropiado para el RNA o la extracción de proteínas. Tenga en cuenta que la oenocytes (segmentos abdominales 2-5) de una mosca macho produce normalmente de 15 20ng de ARN total.
Figura la leyenda:
Figura 1. Expresión de los genes desaturasa, desat1 y desatF, en oenocytes macho y hembra de D. melanogaster. transcripción inversa-PCR de amplificación de desat1 y desatF de ADNc derivados de adultos oenocytes hombres y mujeres. El gen desat1 se expresa tanto en oenocytes hombres y mujeres, expresión desatF es dimorfismo sexual, que se expresa exclusivamente en oenocytes femenino. Correspondientes a estas diferencias en la expresión génica, desat1 se requiere para la producción de compuestos de hidrocarburos comunes a los dos hombres y 9 mujeres, y desatF está involucrado en la producción de compuestos de hidrocarburos específicos de la mujer 10,11. DesatF se ha demostrado que se expresa específicamente en oenocytes mujeres en 12 por hibridación in situ. Tenga en cuenta que en promedio de 15 20ng de ARN total se obtiene de la oenocytes disecados de un vuelo individual. RNA fue aislado utilizando el RNeasy kit micro (Qiagen), cDNA fue producida usando el qScript cDND síntesis kit (Quanta BioSciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este artículo de vídeo se presenta un protocolo de disección detallada para la preparación de la oenocytes de adultos de D. melanogaster de una manera adecuada para el análisis molecular. Un texto basado abreviado en cuenta el método de disección ha sido descrito en otra 2, y la preparación resultante oenocyte ha demostrado ser adecuado para la extracción de ARN y proteínas 2. El uso de este preparado también puede ser posible desarrollar métodos para el cultivo de oenocytes explantados. Un protocolo para una cultura de explante oenocyte ayudaría a las investigaciones encaminadas a determinar la capacidad autónoma del metabolismo de estas células sintetizan y secretan los componentes químicos de los hidrocarburos cuticulares. Estas técnicas en combinación con un recientemente desarrollado oenocyte-Gal4 línea 4, que permite la manipulación genética dirigida de la oenocytes, permitirá el análisis detallado de la genética molecular de la función oenocyte en la mosca de la fruta adultas.
Oenocyte células se encuentran tanto en la larva y la mosca adulta. Mientras que estas células comparten muchas similitudes morfológicas y ultraestructurales, es importante señalar que el oenocytes de la mosca adulta son de desarrollo distintas a las que se diferencian durante el desarrollo embrionario y existen durante cinco estadios larvarios. El oenocytes adultos han reportado que se derivan de los 6 histoblasts, la formación de novo durante la fase de pupa y sigue aumentando en número durante la primera semana de vida del adulto 7. Mientras que el oenocytes de la mosca de la fruta adultas son necesarios para la producción de hidrocarburos cuticulares 4, que queda por determinar si las larvas oenocytes apoyar una función similar. Del mismo modo, las larvas oenocytes mantener hepatocitos como las funciones en relación con el metabolismo lipídico 8, un papel similar aún no ha sido demostrado por oenocytes del adulto. La preparación ha demostrado aquí que facilitar las investigaciones que tienen por objeto determinar el grado en que la oenocytes larvas y adultos son funcionalmente similares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Amsale Belay por su ayuda en la filmación de este artículo de vídeo. Este trabajo fue financiado por CIHR, NSERC y subvenciones CRC a JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
