Summary
I insekter, oenocytes producera cuticular kolväteföreningar. Dessa föreningar skyddar mot uttorkning och underlätta kemisk kommunikation. Här visar vi en dissektion teknik som används för att isolera oenocytes från vuxna
Abstract
I
Protocol
Del 1. Filé beredningen av den vuxna Drosophila buken.
Förfarandet beskrivs omedelbara nedan förbereder buken för avlägsnande av oenocytes (se Del 2 i protokollet). Samma förfarande kan även användas för beredningen av andra vävnader knutna till insidan av nagelband, inklusive dorsala kärl (dvs. hjärtat) och fett kroppen.
Observera att i videon artikeln oenocyte dissektion teknik visas på en vuxen vildtyp (Kanton-S) hane flyga, sex dagar gamla. Identiska tekniker kan användas för att ta bort oenocytes från kvinnliga flugor. Buken filé förberedelser tar cirka 5 minuter att utföra.
Innan du börjar är det viktigt att ha klart flera fina dissektion stift (se nedan och del 2) och en dissektion nål (se del 2). Kommersiellt tillgängliga dissektion av nålar är ofta för stora för detta protokoll, så vi har vidtagit för att tillverka våra egna i laboratorium. För att skapa dissektion nål, volfram tråd (0,005 ") är först träs genom skaftet injektionsnål (27G, aluminium nav). Kabeln tråd genom toppen av injektionsnål så att det framgår av navet. Crimp kabeln utskjutande från navet,. Detta förhindrar att kabeln från att dras ut ur injektionsnål Därefter skär kabeln på motsatt sida på arbetet så att flera millimeter (~ 3-4mm) av tråd sticka ut från toppen av injektionsnålen passerar. spetsen utsätts volfram genom en flamma kommer att skärpa tråden till en mycket fin punkt. en disponibel 5ml plastpipetten när inkilad i navet i injektionsnål fungerar som praktiskt handtag för denna dissektion verktyg. Den fina dissektion stift görs i en liknande sätt. Efter slipningen steget, ta tag i spetsen av kabeln ordentligt med pincett för att förhindra det från att röra sig och göra ett snitt ca 3 mm från spetsen för att frigöra de små dissektion stift. försiktig för att förhindra stift från att slungas ur grepp tången.
Att filé förbereda vuxen Drosophila buken:
- Säkra flyga till dissekering plattan (Sylgard, Dow-Corning) genom att placera ett fint dissektion stift om bröstkorgen.
- Ta bort ben och vingar flyga. Medan du tar bort den mest bakre uppsättning av ben, skapar en öppning i nagelbanden vid en punkt strax främre till där bröstkorgen möter buken. Denna öppning används senare som en accesspunkt för att göra ett snitt längs ventrala yta av buken (se steg 5)
- Säkra buken av flugan på plats genom att placera en andra dissektion stift genom genitala segmentet.
- Täck flyga med kylda Shields och sjöng M3 insekt medium (Sigma). Avlägsna eventuella luftbubblor genom att dra bort det med en pasteurpipett.
- Använd pincett öppna buken genom att göra ett snitt längs med ventrala mittlinjen från öppningen i nagelbanden som skapas genom att ta bort benen till genitala segmentet. Ta bort inälvor och gonader från buken.
- Sever nagelbanden och tracheae ansluta buken på bröstkorgen. Den enda kvarvarande vävnad ansluter buken på bröstkorgen bör hjärtat. Detta ger buken nagelbanden med en viss stabilitet och hindrar den från att rotera eller vrida under nästa steg.
- Pin platt främre flesta hörn av buken nagelbanden. Ta bort bröstkorgen. Dra nagelbanden spända, stift platt bakre hörnen på nagelbanden. Stiftet i underlivet segmentet kan behöva flyttas för att göra nagelbanden låg platt.
Del 2. Oenocyte dissektion
Buken filé förberedelse exponerar insidan av buken nagelband och bifogas vävnader inklusive hjärta, kroppsfett, tracheae, kroppen muskler vägg, överhuden, och oenocytes. Hjärtat ligger längs ryggens mittlinje. Kroppsfett (ogenomskinlig vävnad) omfattar merparten av den inre cuticular ytan. Tracheae (vit Rörarbeten) sträcker sig från den laterala spiracle öppningar och göra omfattande grenar som infiltrera dessa vävnader. Ligga under dessa vävnader, pigmenterade oenocytes (bärnstensfärgad celler) strålar ut från mittlinjen till laterala kanten av nagelband i den bakre regionen av varje segment. Den oenocytes ligger direkt under mörkt brun regionerna i varje tergite (dorsala cuticular plattor) och kan vara svårt att identifiera utan förkunskaper om deras läge. En annan population av ventralt belägna oenocytes är associerad med sternites (ventrala cuticular plattor), även om det är möjligt att isolera dessa celler, kommer denna video protokoll endast visa dissekering av dorsala oenocytes. I varje buken segment, ligger en framstående blad av fett kroppsvävnad anterior till oenocytes, en mindre mindre uppenbart blad av fett kropp ligger posteriort om oenocytes. Den framstående blad av fett kroppsvävnad täcker ofta oenocytes av segmentet som föregår det. Den dorsala fartyg och kroppsfett måste tas bort först för att exponera oenocytes.
Det är viktigt att notera att den gula pigment i oenocytes, från vilken deras namn härleder (oeno - från grekiska ïßíïò, "vin") 1, tydligt skiljer dessa celler från omgivande vävnader, intensiteten på pigment ökar med åldern av flugan. Dessutom ensheathes en basal lamina de oenocytes 2,3, som ger stöd till cellen kluster och hindrar cellerna från att bli dissocierade under dissekering. Den basala lamina hjälper också till att avlägsna extraneously följas vävnader såsom fett kroppsvävnad genom att skapa en svag punkt där dessa sammanväxningar kan lätt störas.
Proceduren som beskrivs nedan innehåller detaljerade instruktioner för borttagning av oenocytes från buken hölje. Den oenocytes kan enkelt avlägsnas från buken segment 2-5 (hane), och 2-6 (hona). Den oenocytes från den första och sista buken segment (segment 1 och 6 hos män eller 7 hos kvinnor) är ofta störs av dissektion stiften som håller hörn nagelband och är därför undvikas. Borttagandet av oenocytes tar ungefär 10 minuter att utföra.
Att isolera den vuxna oenocytes:
- Bryta luftrör stammarna härrör från den spiracles med en dissektion nål.
- Ta bort fettet kropp och hjärta genom att bryta anslutningar till insidan av nagelband med en dissektion nål. För att göra detta, placera punkten på dissektion nål mellan de feta kroppen och oenocytes och dra det från den laterala kanten av nagelband, fram till mittlinjen, flytta under hjärtat, och fortsätter att motsatta sidan. Framåt från den bakre till främre, ta bort fett kroppsvävnad och hjärtat från nagelbanden av varje segment. Om görs noggrant oenocytes sitter kvar på nagelbanden, och fettet kroppen och hjärtat kan tas bort helt.
- Body väggen muskler Spänn oenocytes till insidan av nagelbanden. Använda dissektion nålen skära längsgående muskler kroppen vägg varje segment. För att göra det, dra dissektion nålen längs den bakre sidan av oenocyte strand, försiktigt lyfta dem från ytan av nagelbanden. Den band-liknande oenocyte trådar bör komma bort från nagelbanden och kan läggas åt sidan medan resterande oenocytes tas bort.
- När bort från nagelbanden och ligger på dissekering tallriken kan det vara nödvändigt att rensa bort eventuellt följas fett kroppens vävnad från oenocytes. Detta görs genom att helt enkelt placera dissektion nål mellan de feta kroppens vävnader och oenocytes och bryta anslutningen genom att trycka nålen nedåt och mot dissektion plattan.
- Samla oenocyte trådar genom att helt enkelt peta dem med slutet av dissektion nålen. När fastnat i slutet av dissektion nålen oenocytes kan dras långsamt över ytan av odlingsmedium. Den dissekerade oenocytes kan placeras direkt i cellen lyseringsbuffert lämpliga för antingen RNA eller protein extraktion. Observera att oenocytes (buk-segment 2-5) från en enda manlig flyga normalt ger 15-20ng av totala RNA.
Figur Förklaring:
Figur 1. Redovisning av desaturase gener, desat1 och desatF i manliga och kvinnliga oenocytes av D. melanogaster. omvänd transkription-PCR-amplifiering av desat1 och desatF från cDNA från vuxna manliga och kvinnliga oenocytes. Den desat1 genen uttrycks i både manliga och kvinnliga oenocytes, desatF uttryck är sexuellt dimorfa, uttrycks uteslutande i kvinnliga oenocytes. Motsvarande dessa skillnader i genuttryck desat1 krävs för produktion av kolväteföreningar gemensamma för både män och kvinnor 9, och desatF är involverat i produktionen av kvinnliga specifika kolväteföreningar 10,11. DesatF har visat sig vara specifikt uttryck hos kvinnliga oenocytes med in situ hybridisering 12. Observera att i genomsnitt 15-20ng av totala RNA hämtas från oenocytes dissekerade från en enskild flyga. RNA var isolerat med RNeasy mikro-kit (Qiagen), cDNA producerades med qScript cDND syntes kit (Quanta BioSciences)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video artikeln presenterar vi en detaljerad dissektion protokoll för utarbetandet av oenocytes från vuxna D. melanogaster på ett sätt som lämpar sig för molekylär analys. Ett förkortat textbaserade hänsyn till dissekeringsmetoden har beskrivits på annat håll 2, och den resulterande oenocyte preparatet har visat sig vara lämplig för utvinning av både RNA och protein 2. Med hjälp av detta preparat kan det också vara möjligt att utveckla metoder för odling av explanterade oenocytes. Ett protokoll för en oenocyte Explantation kulturen skulle underlätta utredningar syftar till att fastställa den autonoma metabola kapaciteten av dessa celler att syntetisera och utsöndra kemiska beståndsdelar cuticular kolväten. Dessa tekniker i kombination med en nyutvecklad oenocyte-Gal4 linje 4, som tillåter den riktade genetiska manipulation av oenocytes, kommer att möjliggöra en detaljerad molekylär genetisk analys av oenocyte funktion i den vuxna bananflugan.
Oenocyte celler finns i både larven och den vuxna flugan. Medan dessa celler delar många morfologiska och ultrastrukturella likheter, är det viktigt att notera att oenocytes av den vuxna flugan är utvecklingsmässigt skiljer sig från dem som skiljer under fosterutvecklingen finns under larvstadier 5. Den vuxna oenocytes har rapporterats härledas från histoblasts 6, bildar de novo under pupation och fortsätter att öka i antal under den första veckan i vuxenlivet 7. Medan oenocytes av den vuxna bananfluga krävs för produktion av cuticular kolväten 4, återstår det att bestämmas om larver oenocytes stöder en liknande funktion. Likaså larver oenocytes upprätthålla hepatocyte-liknande funktioner med avseende på lipidmetabolismen 8, en liknande roll har ännu inte visats för oenocytes av den vuxna. Beredningen visade här kommer underlätta utredningar som syftar till att fastställa i vilken grad de larver och vuxna oenocytes är funktionellt likartade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Amsale Belay för hennes hjälp med att filma den här videon artikel. Detta arbete har finansierats av CIHR, NSERC och CRC bidrag till JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
