Summary
斑马鱼已成为一个强大的
Abstract
鉴于他们的小胚胎的大小，快速发展，透明度，繁殖力，以及众多的分子，形态和生理上的相似性，对哺乳动物，已经成为一个强大的斑马鱼
Protocol
1）斑马鱼的卵收集
- 化学屏幕一天前的下午，成立10到20的斑马鱼的繁殖坦克。每个水箱装满水从水产养殖系统。使用渔网，将一个成年男性和一到两个成年女性在每个养殖池的内部容器。独立分频器从对方的男性和女性的鱼。标签的笼子，并把他们的盖子。
- 在屏幕上午上，删除从养殖池的分隔，使斑马鱼进行交配。在未来1小时的课程，让受精卵通过电网秋天在每个内部容器的底部。
- 1小时后，返回成年斑马鱼永久储存罐，取出内部容器，收集鸡蛋，使劲在每个养殖池的水通过塑料茶滤网。
- 反转培养皿中的过滤器和冲洗过滤网轻轻培养皿中，通过使用一个洗瓶的E3媒体冲入鸡蛋。
- 所有未受精卵，从而出现不透明的，应予删除，使用一次性塑料吸管。每次交配交应产生大约200个胚胎。
2）阵列胚胎在96孔板
- 约5到每一个使用玻璃巴斯德吸管96孔板以及胚胎在E3介质的转移。
- 一旦胚胎在96孔板上摆着，消除可能使用12个通道（30 - 300μL）井出的E3媒体的吸管，小心不要穿刺胚胎。使用12道移液器，可提供250μL的E3中每个含有0.5μg/ml卡那霉素以及尽快，以免使胚胎干起来。
- 28.5 °彗星孵化器放入96孔板时要添加的化合物，直到他们达到预期的阶段。
3）转让的小分子库
而化合物转移可自动化与机器人的传输方法，我们将介绍的手动传输方式。
- 小分子库通常在96孔板格式提供，与存储在DMSO为10毫米的股票每个化合物。约60分钟前胚胎到达时，该化合物是无以复加的阶段，解冻所需数量的96等分的小分子（源盘）板。请注意源板的串行或其他识别号码。为了尽量减少对板凝结，解冻可以发生在一个干燥室，含Drierite（WA HAMMOND DRIERITE，森雅，）。
- 在配备多孔板适配器桌面离心机简单自旋向下的板块。
- 从源盘取出铝箔封口胶带。使用12通道移液器，稀释浓度为0.5毫米（例如，如果250 NL等分10mm的股票开始，添加4.75μL二甲基亚砜，每孔）在源盘的化合物。
- 当胚胎在96孔板（收件人板）达到预期的阶段，使用12个通道（2-20μL）移液器从源头上板转移到收件人板块2.5μL化合物（0.5MM）胚胎。
- 记录收件人胚胎板源板的识别号码。现在包含有盖的胚胎和化合物包括收件人板，轻轻混匀，轻轻摇动板，并放置在28.5 ° C培养箱。
- 封面每个源板，铝箔封口胶带和一个-80℃长期储存的冷冻含有未使用的小分子（0.5毫米）。
4）为小分子的影响，通过目视检查表型的筛选
- 执行屏幕前，制定一个什么构成一个“打”的具体标准。
- 在发展中所需的时间从孵化器中含有复合处理的胚胎，取出96孔板和立体显微镜下检查每口井。微妙的变化，如在循环模式的转变，对于更好的可视化，一个相衬倒置显微镜下可以使用。荧光显微镜可用于研究组织特异性启动子的绿色荧光蛋白或DsRed的蛋白表达的扰动。
- 快速扫描以及其中至少3 5胚胎展出规定“砸”表型的96孔板。记录板，和每一个潜在的冲击以及位置的身份。
- 再次确认由复检几个剂量（1微米，5微米，10μm和50微米）的复合型的影响，一个潜在的冲击。每个剂量，10个胚胎在0.5毫升在48孔板格式的E3媒体测试。复方此外复检的时间应该是相同的的原筛查。一击确认复检的compoun转载时引起的表型ð
- 确定从的小分子化学库中的数据库的命中化合物。
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Discussion
规划斑马鱼为基础的化学屏幕时，必须特别注意正在审议的表型，这种表型的背景率的稳健性。诱导表型的化学抑制器的屏幕，这一点尤为重要。例如，对于引起热休克诱导转基因表型，导致表型的条件下再现，必须精确地映射出启动屏幕前，以避免不可接受的高误报率。通过精心规划，斑马鱼化工屏幕，这就需要适度的资本投资，可能会导致的细胞信号转导和生理的新型调制器的发现，以及铅化合物，扭转人类疾病的模型。最后，比喻经典的遗传筛选，斑马鱼为基础的化学屏幕可对化学基本的生物过程的遗传剖析宝贵。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype. | |||
| Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats). | |||
| Petri dishes (10 cm). | |||
| Plastic tea strainer. | |||
| Wash bottle containg embryo water. | |||
| Disposable polyethylene transfer pipettes. | |||
| Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA). | |||
| Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific). | |||
| Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). | |||
| E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil. | |||
| 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf). | |||
| 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf). | |||
| Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific). | |||
| Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use. | |||
| Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY). | |||
| DMSO (Sigma, St. Louis, MO). | |||
| Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific). | |||
| Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). |
References
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