Summary
Zebra balığı güçlü olarak ortaya çıkmıştır
Abstract
, Küçük embriyo boyutu, hızlı bir gelişme, şeffaflık, doğurganlık ve memeliler için çok sayıda moleküler, morfolojik ve fizyolojik benzerlikleri göz önüne alındığında, zebrafish güçlü olarak ortaya çıkmıştır
Protocol
1) Zebra balığı Yumurta Toplama
- Kimyasal ekran gün önce öğleden sonra, 10 ila 20 Zebra balığı üreme tankları kurdu. Her bir tank su ile yetiştiricilik sistemi doldurun. Bir balık ağı kullanarak, her bir yetiştirme tankında iç konteyner bir yetişkin erkek ve 01:59 yetişkin kadın aktarın. Bir bölücü ile erkek ve dişi balık birbirinden ayırın. Kafesleri Etiket ve üzerlerine bir kapak koydu.
- Ekranın sabah, üreme tankları bölücüler kaldırmak ve çiftleşmek için zebrafish izin. Önceki 1 saat boyunca, döllenmiş yumurta her iç konteyner alt kısmında ızgara üzerinden düşmesine izin vermeyin.
- 1 saat sonra, kalıcı depolama tankları yetişkin zebrafish geri dönüş iç kabı çıkarın ve bir plastik çay süzgeci ile her bir yetiştirme tankında su süzme yumurta toplamak.
- Petri kabı üzerinden süzgeci ters çevirin ve E3 orta içeren bir yıkama şişesi kullanarak Petri kabı içine yumurtaları temizlemek için yavaşça süzgeç durulayın.
- Opak görünür tüm döllenmemiş yumurta, tek bir plastik pipet kullanarak çıkarılmalıdır. Her çiftleşme çapraz yaklaşık 200 embriyolar verim gerekir.
2) 96-kuyu Tabaklar Embriyolar Arraying
- 5, 96 plaka bir cam Pasteur pipeti kullanarak her bir kuyunun içine E3 ortamda embriyolar hakkında aktarın.
- Embriyo ponksiyon bakım alarak, pipet embriyolar 96-plaka üzerine dizilmiş, bir 12-kanal (300 mcL 30) kullanarak kuyuların mümkün olabildiğince kadar E3 orta kaldırmak. 12-kanallı pipet kullanarak, böylece embriyolar kadar kuruması için izin vermemek için de mümkün olduğunca çabuk, her 0.5μg/ml kanamisin içeren E3 orta 250 mcL sunmak.
- 96-kuyucuğu bileşikler eklenecek zaman istenilen aşamaya ulaşmak kadar 28.5 ° C inkübatör içine koyun.
3) Küçük Molekül Kütüphanesi Devri
Bileşik transferi robotik transfer yöntemleri ile otomatik olabileceği gibi, biz manuel aktarma yöntemini anlatacağız.
- Küçük molekül kütüphaneleri, tipik olarak 10 mM stok olarak DMSO saklanan her bileşik ile, 96-well formatında temin edilmektedir. Bileşikler eklenecek embriyolar aşamaya ulaşmak yaklaşık 60 dakika önce, küçük moleküller aynı hacimde (kaynak plaka) içeren 96-kuyucuğu İstediğiniz bir numarayı Çözülme. Kaynak plakaların seri veya diğer kimlik numarası dikkate alınız. Plakalar üzerinde yoğunlaşma en aza indirmek için, buz eritme Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH) içeren bir kuruma odasında oluşabilir.
- Kısaca çok plaka adaptörü ile donatılmış bir masa üstü santrifüj plakaları dönerler.
- Kaynak plaka alüminyum sızdırmazlık bantı çıkarın. 12-kanallı pipet kullanarak, kaynak plaka bileşiklerin konsantrasyonu 0.5 mM (örneğin, 250 nL alikotları 10mM stok ile başlayan, her bir kuyunun 4.75 mcL DMSO eklemek) seyreltin.
- 96-plaka embriyoların (alıcı plaka) istenilen aşamaya ulaşmak, alıcı plakalar içeren kaynak plakaları bileşiklerin 2.5μL (0.5mm) aktarmak için bir 12-kanal (2-20 mcL) pipet kullanın embriyoların.
- Alıcı embriyo plakalar üzerinde kaynak plakalarının kimlik numarasını kaydedin. Kapak kapakları ile embriyoların ve bileşikleri içeren alıcı plakaları, yavaşça yavaşça dönen plakalar karışımı, ve 28.5 ° C inkübatör koyun.
- Uzun süreli saklama için -80 ° C derin dondurucuda alüminyum sızdırmazlık bantı ve yer ile kullanılmayan küçük moleküller (0.5 mM) içeren her kaynak plaka Kapak.
4) Küçük Moleküllerin Etkileri fenotipleri Görsel Muayene Tarama
- Ekranın gerçekleştirmeden önce, ne bir "hit" teşkil edeceğini için belirli bir kriter formüle.
- Gelişimi istenilen zamanlarda, inkübatör bileşik tedavi edilen embriyolar içeren 96-kuyucuğu çıkarın ve bir stereomikroskop altında her iyi incelemek. Dolaşım desen değişiklikleri gibi ince değişiklikler, daha iyi bir görünüm için, ters faz-kontrast mikroskop kullanılabilir. Floresan mikroskobu, bir doku spesifik organizatörü altında GFP veya DsRed proteinleri ifade pertürbasyon incelemek için kullanılabilir.
- 5 embriyo en az 3 öngörülen "hit" fenotip sergileyen herhangi bir kuyu için 96-kuyucuğu hızla tarayın. Kimlik, plaka ve her potansiyel hit iyi bir konuma kaydedin.
- Çeşitli dozlarda (1 UM, 5 UM, 10 mcM ve 50 mcM) bileşik etkileri yeniden test potansiyel bir hit teyit. Her doz için 48 plaka formatında E3 medya 0.5 ml, 10 embriyolar test edilmektedir. Test için bileşik Ayrıca zamanlama orijinal tarama aynı olmalıdır. Hit ortaya çıkardı fenotip compoun, yeniden test yeniden teyitd
- Küçük moleküllerin kimyasal kütüphane veritabanı isabet bileşik belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish bazlı kimyasal ekran planlama yaparken özellikle dikkat sağlamlık fenotip ve arka plan gibi fenotip oranı dikkate alınarak ödenmelidir. Bu kimyasal bastırıcılar kaynaklı bir fenotip ekranlar için özellikle önemlidir. Örneğin, bir transgen ısı-şok indüksiyon kaynaklanan bir fenotip, fenotipe neden olan durum tekrarlanabilir kabul edilemeyecek kadar yüksek yalancı pozitiflik oranları önlemek için tam ekran başlamadan önce eşlenmiş olmalıdır. Dikkatli bir planlama ile, mütevazı bir sermaye yatırımı gerektirir zebrafish kimyasal ekranlar, hücre sinyal iletimi ve fizyoloji roman modülatör keşfi, yanı sıra insan hastalıklarının modelleri tersine çevirmek için kurşun bileşik yol açabilir. Son olarak, klasik genetik ekranlar için benzetme, temel biyolojik sürecin kimyasal genetik diseksiyonu zebrafish bazlı kimyasal ekranları için değerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype. | |||
| Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats). | |||
| Petri dishes (10 cm). | |||
| Plastic tea strainer. | |||
| Wash bottle containg embryo water. | |||
| Disposable polyethylene transfer pipettes. | |||
| Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA). | |||
| Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific). | |||
| Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). | |||
| E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil. | |||
| 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf). | |||
| 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf). | |||
| Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific). | |||
| Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use. | |||
| Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY). | |||
| DMSO (Sigma, St. Louis, MO). | |||
| Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific). | |||
| Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). |
References
- Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
- Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
- Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
- Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).
