בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Summary

דג הזברה התפתחה חזקה

Abstract

לאור גודל העובר הקטן שלהם, הפיתוח המואץ, שקיפות, פוריות, ונקודות הדמיון המולקולרי, מורפולוגיים ופיזיולוגיים רבים יונקים, דג הזברה התפתחה חזקה

Protocol

1) דג הזברה אוסף ביצה

1. באחר הצהריים שלפני יום של המסך כימיים, להקים 10-20 רבייה טנקים דג הזברה. ממלאים כל מיכל עם מים ממערכת מדגה. שימוש נטו דג, העברת זכר אחד בוגר 1-2 נקבות בוגרות למיכל הפנימי במיכל כל הרבייה. הפרד את הדג הזכר והנקבה זה מזה עם מחיצה. לייבל הכלובים לשים מכסה עליהם.
2. בבוקרו של המסך, להסיר את המחיצות מטנקים הרבייה ולאפשר דג הזברה להזדווג. במשך שעה 1 הבא, לאפשר ביציות מופרות ליפול דרך רשת בתחתית המיכל הפנימי כל אחד.
3. אחרי שעה 1, להחזיר דג הזברה הבוגרת חזרה מיכלי אחסון קבועים, להסיר את המיכל הפנימי לאסוף את הביצים על ידי מאמץ את המים במיכל כל הרבייה דרך מסננת תה פלסטיק.
4. היפוך מסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף את מסננת כדי לשטוף בעדינות את הביצים אל תוך צלחת פטרי באמצעות בקבוק המכיל לשטוף את המדיום E3.
5. ביצים כל מופרית, אשר מופיעים אטום, יש להסיר בעזרת פיפטה פלסטיק חד פעמיות. כל אחד צריך לעבור הזדווגות להניב כ -200 עוברים.

2) עריכה עוברים 96-גם צלחות

1. העברה על 5 עוברים בינוני E3 לבאר כל צלחת 96-היטב באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
2. לאחר עוברים הם ערוכים לצלחת 96-היטב, להסיר כמה שיותר המדיום E3 כפי האפשרי של הבארות באמצעות ערוץ 12 (3-30 μL) פיפטה, נזהרת שלא לנקב את העובר. בעזרת פיפטה 12 ערוצים, לספק 250 μL של המדיום E3 המכיל kanamycin 0.5μg/ml זה טוב כמה שיותר מהר כדי לא לאפשר עוברים להתייבש.
3. שים את לוחות 96-היטב 28.5 ° C החממה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי כאשר תרכובות להתווסף.

3) העברת ספריית מולקולה קטנה

אמנם העברת המתחם יכול להיות אוטומטי עם שיטות העברת רובוטית, נתאר את שיטת העברה ידנית.

1. ספריות מולקולה קטנה מסופקים בדרך כלל בפורמט 96-היטב, עם כל תרכובת מאוחסנים DMSO כמו מניה 10 מ"מ. כ -60 דקות לפני העוברים מגיעים לשלב שבו הם תרכובות להתווסף, הפשרה המספר הרצוי של 96-היטב צלחות המכילות aliquots של מולקולות קטנות (צלחת מקור). שימו לב מספר זיהוי סדרתי או אחר של צלחות המקור. כדי למזער עיבוי על הצלחות, מפשיר יכול להתרחש בתא התייבשות המכיל Drierite (WA המונד DRIERITE CO, קסניה, OH).
2. ספין בקצרה את לוחות בצנטריפוגה השולחן מצויד מתאם רב גם צלחת.
3. הסר את הסרט איטום אלומיניום מהצלחת המקור. בעזרת פיפטה 12 ערוצים, לדלל את התרכובות בצלחת מקור לריכוז של 0.5 מ"מ (לדוגמה, אם מתחילים עם 250 aliquots NL של המניה 10mm, להוסיף 4.75 μL של DMSO זה טוב).
4. כאשר עוברים בצלחת 96-היטב (צלחת הנמען) מגיעים לשלב הרצוי, השתמש 12 ערוצים (20-20 μL) פיפטה להעביר 2.5μL של תרכובות (0.5mm) מהצלחות מקור לתוך צלחות הנמען המכיל את עוברים.
5. רשום את מספר הזיהוי של מקור צלחות על צלחות העובר הנמען. מכסים את הצלחות הנמען עכשיו המכיל את העוברים ותרכובות עם מכסים, מערבבים בעדינות את הצלחות על ידי בעדינות מתערבל, ולמקם אותם בתוך 28.5 ° C חממה.
6. כיסוי כל צלחת מקור המכיל מולקולות קטנות שאינן בשימוש (0.5 מ"מ) עם סרט אלומיניום איטום ומניחים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך.

4) הקרנת עבור אפקטים של מולקולות קטנות, על ידי בדיקה ויזואלית של פנוטיפים

1. לפני ביצוע המסך, לגבש אמת מידה ספציפית מה יהווה "מכה".
2. לפעמים הרצוי בפיתוח, להסיר את פלטות 96-תרכובת המכילה גם מטופלים העוברים מן החממה ולבחון היטב תחת כל stereomicroscope. עבור ויזואליזציה טובה יותר של שינויים עדינים, כגון שינויים בדפוס הדם, מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך יכול לשמש. מיקרוסקופיה פלורסנט יכול לשמש כדי לבחון ההפרעות הביטוי של ה-GFP או חלבונים DsRed תחת האמרגן רקמות ספציפיות.
3. במהירות הסריקה 96-היטב הצלחות גם כל אשר לפחות 3 מתוך 5 עוברים התערוכה הקבועה פנוטיפ "מכה". הקלט את זהותו של הצלחת ומיקום טוב של כל נפגע פוטנציאלי.
4. לאשרר להיט פוטנציאלי על ידי retesting על השפעותיה של התרכובת במינונים שונים (1 אממ, 5 UM, 10 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר). עבור כל מנה, 10 עוברים נבדקים 0.5 מ"ל של התקשורת E3 בפורמט 48-היטב צלחת. עיתוי בנוסף מתחם עבור retesting צריך להיות זהה לזה של ההקרנה המקורי. מכה כאשר הוא אישר את הפנוטיפ שהושרו מתנוסס על retesting של compounד
5. זהה את מתחם פגע ממסד הנתונים של מולקולות קטנות בספריה כימיים.

Discussion

כאשר מתכננים דג הזברה מסך מבוססי כימיים, תשומת לב מיוחדת יש לשלם חוסנו של פנוטיפ הנדונה לבין שיעור הרקע של פנוטיפ כזה. הדבר חשוב במיוחד עבור מסכי עבור מדכאי הכימי של פנוטיפ המושרה. לדוגמה, עבור פנוטיפ הנגרם על ידי אינדוקציה חום הלם transgene, מצב שגורם את הפנוטיפ reproducibly חייב להיות ממופה החוצה בדיוק לפני שיזם את המסך כדי למנוע גבוה בלתי מתקבל על הדעת שיעורי חיובי כוזב. עם תכנון קפדני, מסכי דג הזברה כימיים, אשר דורשים השקעות הון צנוע, יכולה להוביל לגילוי של אפנן הרומן של תא האיתות ופיזיולוגיה, וכן מתחם להוביל הפוך מודלים של מחלות אנושיות. לבסוף, על ידי אנלוגיה קדימה מסכי קלאסי גנטית, דג הזברה מבוססי מסכי כימי יכול להיות בעל ערך לנתיחה כימיים הגנטי של תהליך ביולוגי בסיסי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number
Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
Petri dishes (10 cm).
Plastic tea strainer.
Wash bottle containg embryo water.
Disposable polyethylene transfer pipettes.
Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).