Biology

बड़े पैमाने पर Zebrafish आधारित Vivo में लघु अणु स्क्रीन

Published: December 30, 2010 doi: 10.3791/2243

Jijun Hao¹, Charles H. Williams¹, Morgan E. Webb¹, Charles C. Hong^1,2,3,4

¹Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, ²Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, ³Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, ⁴Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

Summary

Zebrafish एक शक्तिशाली रूप में उभरा है

Abstract

उनके छोटे भ्रूण आकार, तेजी से विकास, पारदर्शिता, उपजाऊपन, और स्तनधारियों के लिए कई आणविक, morphological और शारीरिक समानता को देखते हुए, zebrafish एक शक्तिशाली रूप में उभरा है

Protocol

1) Zebrafish अंडे संग्रह

रासायनिक स्क्रीन के दिन से पहले दोपहर में 10 से 20 zebrafish प्रजनन टैंक सेट. प्रत्येक टैंक जलीय कृषि प्रणाली से पानी के साथ भरें. एक मछली जाल का प्रयोग, प्रत्येक प्रजनन टैंक में आंतरिक कंटेनर के लिए एक वयस्क पुरुष और एक को दो वयस्क महिलाओं का हस्तांतरण. एक विभक्त के साथ अलग एक दूसरे से नर और मादा मछली. पिंजरों लेबल और उन पर एक ढक्कन डाल दिया.
स्क्रीन की सुबह पर, प्रजनन टैंक से डिवाइडर हटाने और दोस्त के लिए zebrafish की अनुमति. अगले 1 घंटे के दौरान निषेचित अंडे ग्रिड के माध्यम से प्रत्येक आंतरिक कंटेनर के नीचे गिर करने के लिए अनुमति देते हैं.
1 घंटे के बाद, वयस्क zebrafish स्थायी भंडारण टैंक के लिए वापस लौटने भीतर कंटेनर हटाने और प्रत्येक प्रजनन टैंक में एक प्लास्टिक की चाय का झरनी के माध्यम से पानी के दबाव से अंडे इकट्ठा.
एक पेट्री डिश पर झरनी उलटें और झरनी धीरे कुल्ला पेट्री डिश में एक धोने E3 मध्यम युक्त बोतल का उपयोग करके अंडे फ्लश.
सभी unfertilized अंडे, जो अपारदर्शी दिखाई देते हैं एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर हटाया जाना चाहिए. प्रत्येक संभोग के पार लगभग 200 भ्रूण उपज चाहिए.

2) 96 अच्छी तरह प्लेट्स में भ्रूण Arraying

E3 के मध्यम में भ्रूण के बारे में एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करके एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 5 स्थानांतरण.
एक बार भ्रूण 96 अच्छी तरह से थाली पर arrayed रहे हैं, (30 - 300 μL) 12 चैनल का उपयोग कुओं के बाहर के रूप में संभव के रूप में E3 के माध्यम से बहुत हटायें पिपेट, भ्रूण पंचर करने के लिए देखभाल नहीं ले रही. 12 चैनल विंदुक का प्रयोग, E3 के माध्यम से प्रत्येक के लिए 0.5μg/ml kanamycin युक्त 250 μL में अच्छी तरह के रूप में जल्दी संभव के रूप में देने इतनी के रूप में अनुमति देने के लिए नहीं भ्रूण सूख.
28.5 ° सी इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह प्लेटें रखो जब तक वे वांछित मंच तक पहुँचने जब यौगिकों जोड़ा जा करने के लिए.

3) लघु अणु लाइब्रेरी का स्थानांतरण

जबकि यौगिक हस्तांतरण रोबोट हस्तांतरण विधियों के साथ स्वचालित किया जा सकता है है, हम पुस्तिका हस्तांतरण विधि का वर्णन करेंगे.

छोटे अणु पुस्तकालयों को आम तौर पर एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में प्रत्येक DMSO में एक 10 मिमी शेयर के रूप में संग्रहीत परिसर के साथ की आपूर्ति कर रहे हैं. के बारे में 60 मिनट पहले भ्रूण अवस्था तक पहुंचने में जब यौगिकों करने के लिए जोड़ा जा रहे हैं, 96 अच्छी तरह से छोटे अणुओं की aliquots (स्रोत थाली) से युक्त प्लेटों के एक वांछित संख्या से गल. सीरियल या अन्य स्रोत प्लेटों की पहचान संख्या को ध्यान में रखना. प्लेटों पर संक्षेपण कम से कम करने के लिए, विगलन एक desiccation Drierite (WA Hammond DRIERITE सीओ, Xenia, OH) युक्त कक्ष में हो सकता है.
संक्षेप में नीचे एक tabletop बहु - अच्छी तरह से थाली अनुकूलक के साथ सुसज्जित अपकेंद्रित्र में प्लेटें स्पिन.
स्रोत थाली से एल्यूमीनियम सील टेप निकालें. एक 12 चैनल विंदुक का प्रयोग, 0.5 मिमी की एकाग्रता (उदाहरण के लिए, अगर 10mm शेयर के 250 nl aliquots के साथ शुरू, एक अच्छी तरह DMSO के 4.75 μL जोड़ने) स्रोत थाली में यौगिकों पतला.
जब 96 अच्छी तरह से थाली में भ्रूण (प्राप्तकर्ता थाली) वांछित स्तर तक पहुँचने के लिए, स्रोत प्लेटों से प्राप्तकर्ता युक्त प्लेटों में यौगिकों के 2.5μL (0.5mm) स्थानांतरण (2-20 μL) 12 चैनल पिपेट का उपयोग भ्रूण.
प्राप्तकर्ता भ्रूण प्लेटों पर स्रोत प्लेटों की पहचान संख्या रिकार्ड. प्राप्तकर्ता अब भ्रूण और lids के साथ यौगिकों से युक्त प्लेटों को कवर करने के लिए, धीरे धीरे घूमता प्लेटें मिश्रण है, और एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उन्हें जगह.
प्रत्येक स्रोत के साथ एक एल्यूमीनियम -80 ° सी लंबी अवधि के भंडारण के लिए फ्रीज़र में सील और टेप जगह अप्रयुक्त छोटे अणुओं (0.5 मिमी) से युक्त थाली कवर.

4) phenotypes के दृश्य निरीक्षण के द्वारा छोटे अणुओं के प्रभाव के लिए स्क्रीनिंग

स्क्रीन प्रदर्शन से पहले, क्या एक 'हिट' का गठन होगा के लिए एक विशिष्ट कसौटी तैयार.
विकास में वांछित समय में, 96 अच्छी तरह इनक्यूबेटर से युक्त यौगिक इलाज भ्रूण प्लेटें निकालने और stereomicroscope तहत प्रत्येक अच्छी तरह से जांच. संचार पैटर्न में परिवर्तन के रूप में में सूक्ष्म परिवर्तन के बेहतर दृश्य के लिए एक चरण विपरीत उलटा माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा सकता है. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के एक ऊतक विशेष के प्रमोटर के तहत GFP या DsRed प्रोटीन की अभिव्यक्ति की गड़बड़ी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
जल्दी से किसी भी अच्छी तरह से जिस में कम से कम 5 भ्रूण के बाहर 3 निर्धारित "हिट" phenotype प्रदर्शन के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें स्कैन. प्लेट और प्रत्येक संभावित हिट की अच्छी तरह से स्थान की पहचान रिकार्ड.
कई खुराक (1 उम, 5 उम, 10 सुक्ष्ममापी और 50 सुक्ष्ममापी) पर परिसर के प्रभाव retesting द्वारा एक संभावित हिट Reconfirm. प्रत्येक खुराक के लिए, 48 अच्छी तरह से एक थाली प्रारूप में E3 मीडिया के 0.5 एमएल में 10 भ्रूण परीक्षण कर रहे हैं. retesting के लिए इसके अलावा परिसर के समय मूल स्क्रीनिंग के समान होना चाहिए. एक हिट की पुष्टि की है जब हासिल phenotype compoun के retesting पर reproduced हैघ
रासायनिक लायब्रेरी में छोटे अणुओं के डेटाबेस से हिट यौगिक पहचानें.

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Discussion

जब एक रासायनिक zebrafish आधारित स्क्रीन की योजना बना, विशेष रूप से ध्यान विचाराधीन phenotype और ऐसे phenotype की पृष्ठभूमि दर की मजबूती के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. यह एक प्रेरित phenotype के रासायनिक दमन के लिए स्क्रीन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, गर्मी झटका एक transgene की प्रेरण की वजह से phenotype के लिए शर्त है कि phenotype लाती reproducibly ठीक बाहर चाहिए पहले मैप करने के लिए स्क्रीन की शुरुआत करने के लिए unacceptably उच्च झूठी सकारात्मक दर से बचने के. सावधान योजना के साथ, zebrafish रासायनिक स्क्रीन है, जो मामूली पूंजी निवेश की आवश्यकता है संकेतन सेल और शरीर विज्ञान के उपन्यास न्यूनाधिक की खोज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नेतृत्व करने के लिए मानव रोगों के मॉडल रिवर्स यौगिक के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अन्त में, क्लासिक आगे आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए सादृश्य द्वारा, zebrafish आधारित रासायनिक स्क्रीन मौलिक जैविक प्रक्रिया के रासायनिक आनुवंशिक विच्छेदन के लिए मूल्यवान किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number
Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
Petri dishes (10 cm).
Plastic tea strainer.
Wash bottle containg embryo water.
Disposable polyethylene transfer pipettes.
Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ , 0.33 mM MgSO₄ , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).