Large Scale Zebrafish-Based In vivo Småmolekylära skärm

Summary

Zebrafisk har framträtt som ett kraftfullt

Abstract

Med tanke på deras lilla embryo storlek, snabb utveckling, öppenhet, fruktsamhet, och många molekylära, morfologiska och fysiologiska likheter med däggdjur, har zebrafisk framträtt som ett kraftfullt

Protocol

1) Zebrafish insamling av ägg

1. På eftermiddagen före dagen för den kemiska skärmen, ställa in 10 till 20 stridsvagnar zebrafisk avel. Fyll varje tank med vatten från vattenbruk systemet. Använda en fisk nät, överföring en vuxen hane och en till två tikar vuxen att innerbehållare i varje avel tank. Separera hanar och honor från varandra med en avdelare. Märk burar och lägga ett lock över dem.
2. På morgonen av skärmen, ta bort avdelare från avel tankar och låta zebrafisk att para sig. Under loppet av nästa 1 timme, låt befruktade ägg att falla genom rutnätet vid botten på varje inre behållaren.
3. Efter 1 timme, retur vuxen zebrafisk tillbaka till permanent lagring tankar, ta bort den inre behållaren och samla in ägg genom att anstränga vattnet i varje avel tanken genom en plast tesil.
4. Vänd sil över en petriskål och skölj silen försiktigt att spola äggen i petriskålen med hjälp av en tvättflaska innehåller E3 medium.
5. Alla obefruktade ägg, som visas ogenomskinliga, bör tas bort med en disponibel plast pipett. Varje parning kors ska ge cirka 200 embryon.

2) Arraying embryon i 96-brunnars plattor

1. Överför ca 5 embryon i E3 medium till varje brunn på en 96-brunnar med hjälp av ett glas pasteurpipett.
2. När embryon klädd på 96-brunnar, ta bort så mycket av E3 medium som möjligt av brunnarna med ett 12-kanals (30 - 300 mikroliter) pipett noga med att inte punktera embryot. Med hjälp av 12-kanals pipett leverera 250 mikroliter av E3 medium innehållande 0.5μg/ml kanamycin till varje brunn så snabbt som möjligt så att inte tillåta embryon att torka upp.
3. Sätt 96-brunnar till 28,5 ° C inkubator tills de når den önskade skede när de föreningar som ska läggas till.

3) Överföring av små molekyler bibliotek

Medan förening överföringen kan automatiseras med robot överföringsmetoder, kommer vi att beskriva den manuella överföringsmetod.

1. Liten molekyl bibliotek är oftast levereras i en 96-bra format, med varje förening som lagras i DMSO som en 10 mm lager. Om 60 minuter innan embryon nå det stadium då de föreningar som ska läggas, tina ett önskat antal plattor med 96 brunnar innehåller alikvoter av små molekyler (källa plåt). Ta del av den seriella eller annat identifikationsnummer källan plattorna. För att minimera kondens på plattorna, kan upptining uppstå i en uttorkning kammare som innehåller Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. Kortfattat spinn ner plattorna i en bordsskiva centrifug telefon med flera brunnar adapter.
3. Ta bort tejpen aluminium tätning från källa plattan. Med hjälp av en 12-kanals pipett, späd föreningar i källan plattan koncentrationen av 0,5 mm (till exempel om börjar med 250 nL alikvoter 10 mM lager, lägga till 4,75 mikroliter av DMSO till varje brunn).
4. När embryona i 96-håls platta (mottagaren plåt) når den önskade scenen, använder en 12-kanals (2-20 mikroliter) pipett överföra 2.5μL av föreningar (0,5 mm) från källan plattorna till mottagaren plattorna innehåller embryon.
5. Anteckna identifikationsnummer källan plattor på plattorna mottagaren embryot. Täck mottagaren plattorna nu innehåller embryon och föreningar med lock, blanda försiktigt plattorna genom att försiktigt snurra, och placera dem i en 28,5 ° C inkubator.
6. Täck varje källa skylt som innehåller oanvända små molekyler (0,5 mm) med en aluminium förseglingstejpen och placera i en -80 ° C frys för långtidsförvaring.

4) Screening för effekterna av små molekyler genom visuell inspektion av fenotyper

1. Innan du utför skärmen, formulera ett särskilt kriterium för vad som skulle utgöra en "hit".
2. Vid önskade tidpunkter i utvecklingen, ta bort 96-brunnar som innehåller substansen behandlade embryon från inkubatorn och undersöka varje brunn under ett stereomikroskop. För bättre visualisering av subtila förändringar, såsom förändringar i cirkulationssystemet mönster, kan ett faskontrast inverterat mikroskop användas. Fluorescerande mikroskopi kan användas för att undersöka störning av uttryck av GFP eller DsRed proteiner i en vävnad-specifika promotorn.
3. Snabbt skanna 96-brunnar för väl där minst 3 av 5 embryon uppvisar de föreskrivna "hit" fenotyp. Registrera identiteten på plattan och väl plats för varje potentiell träff.
4. Bekräfta en potentiell drabbats av omprovning effekterna av föreningen på flera doser (1 um, 5 um, 10 mikrometer och 50 M). För varje dos är 10 embryon testas i 0,5 ml E3 media i en 48-brunnar format. Tidpunkten för föreningen tillägg för omprovning bör vara identisk med den ursprungliga screening. En träff bekräftas när framkallade fenotyp återges på omtest av compound
5. Identifiera träffen förening från databasen av små molekyler inom den kemiska bibliotek.

Discussion

När du planerar en zebrafisk-baserade kemiska skärmen, måste särskild uppmärksamhet ägnas åt den robusthet fenotyp i fråga och bakgrunden graden av sådan fenotyp. Detta är särskilt viktigt för skärmar för kemisk förtrycker en inducerad fenotyp. Till exempel för en fenotyp på grund av värme-chock induktion av en transgen, reproducerbart förutsättning att inducerar fenotyp måste vara exakt kartläggas före start skärmen för att undvika oacceptabelt höga falska positiva priser. Med noggrann planering kan zebrafisk kemisk-skärmar, vilket kräver blygsamma investeringar, leda till upptäckten av nya modulator av cellsignalering och fysiologi, samt leda förening att vända modeller för mänskliga sjukdomar. Slutligen, i analogi med den klassiska fram genetiska skärmar kan zebrafisk-baserade kemiska skärmar vara värdefull för kemisk genetiska dissekering av grundläggande biologiska processen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number
Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
Petri dishes (10 cm).
Plastic tea strainer.
Wash bottle containg embryo water.
Disposable polyethylene transfer pipettes.
Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).