Summary
هذا البروتوكول توضح طريقة موثوقة لالتخدير والتصوير من دون تغيير
Abstract
وقد مكنت التحسينات التي حدثت مؤخرا في مجال التصوير الضوئي ، fluorophores المرمزة وراثيا والأدوات الوراثية السماح بإنشاء كفاءة الحيوانات المعدلة وراثيا خطوط المطلوب أن يكون درس العمليات البيولوجية في سياق لقمة العيش ، ويتصرف في بعض الحالات بل والحي. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح كيفية تخدير يرقات ذبابة الفاكهة سليمة ، وذلك باستخدام مخدر desflurane متقلبة ، لمتابعة تطوير واللدونة متشابك من السكان في القرار 03/01 شبه الخلوية. بينما الأساليب الأخرى المفيدة لتخدير يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن وقد وصفت سابقا 4،5،6،7،8 ، البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة يوضح تحسينات كبيرة بسبب الميزات الرئيسية التالية مجتمعة : (1) وجود درجة عالية جدا من التخدير ، وحتى تم القبض ضربات القلب مما يسمح القرار الوحشي تصل إلى 150 نانومتر 1 ، (2) معدل البقاء على قيد الحياة مرتفعة من 90 ٪> التخدير لكل دورة ، والسماح في تسجيل أكثر من خمس نقاط لمرة وعلى مدى فترة من ساعات إلى أيام 2 و ( 3) حساسية عالية تمكننا 2 في الحالات لدراسة ديناميات بروتينات التي أعرب عنها في المستويات الفسيولوجية. في التفاصيل ، كنا قادرين على تصور مستقبل الغلوتامات بعد المشبكي الوحيدات GluR - IIA أعرب عبر المروج الذاتية 1 في خطوط المعدلة وراثيا ومستقرة خط فخ اكسون FasII GFP - 1. (4) وخلافا لأساليب أخرى يمكن تصوير 4،7 اليرقات ليس فقط على قيد الحياة ، ولكن أيضا سليمة (أي غير تشريح) السماح الملاحظة أن تحدث على مدى عدة أيام 1. تفاصيل الفيديو المرافقة وظيفة الأجزاء الفردية من الجسم الحي في غرفة التصوير 2،3 ، والصحيح المتصاعدة من اليرقات ، وإجراء التخدير ، وكيفية إعادة تحديد مواقف معينة داخل يرقة وإزالة آمنة من اليرقات من التصوير الغرفة.
Protocol
أ) الجمعية العامة للغرفة التصوير
- حدد مرحلة اليرقة المختارة (مثلا في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة ترك فاصل زمني رصد حوالي 24 ساعة عند 25 درجة مئوية حتى يتجول المرحلة).
- اليرقة شطف مع الماء لتنظيفه من المتوسط الثقافة والداب لتجف.
- معطف وسط عنصر السفلي من الغرفة ، والمنطقة لمواجهة اليرقة ، مع طبقة رقيقة من النفط الهالوكربون.
- وضع اليرقة مع الجانب البطنية التي تواجه الهدف المجهر في الغرفة (يسمح الوصل العصبي العضلي (NMJ) 26 و 27 ليمكن تصوير) (الشكل 1 AE).
- هل وضع طبقة من البلاستيك على النفط ، مع فتحات الهواء صعودا من مواجهة الشبكة (الشكل 1 أ). الرجاء التحقق في هذه الخطوة : إن ارتفاع هل هو ما يقرب من نصف قطرها اليرقات ، وينبغي عرض الشق يكون حوالي ضعف قطر اليرقة.
- المكان قاعة التصوير على المجهر
ب) التخدير لليرقة
- ربط مداخل اثنين من غرفة مع جهاز التخدير المناسبة / المرذاذ.
يرجى التحقق مقدما :
وينبغي التركيز الفعال لdesflurane في الهواء غرفة لا تتجاوز تلك المحددة في لوائح السلامة! وهناك حاجة فقط حجم صغير جدا من مجموع desflurane لتخدير اليرقات. وقد أثبت تطبيق 15 ٪ (V / V) من 1 desflurane أن تكون نقطة انطلاق جيدة لتحديد تركيز مثالية لاستخدامها في تجربة. لأسباب تتعلق بالسلامة نقترح أن المرذاذ ينبغي أبدا تحتوي على أكثر من اللازم desflurane لمدة 2-4 ساعات من التصوير في الجسم الحي. - تزج في الطرف الآخر من الأنبوب تعلق على منفذ الغرفة في كوب من الماء ثم فتح صمامات التحكم في تدفق المخدر الى داخل القاعة لحوالي خمس ثوان.
يرجى التحقق على هذه الخطوة :
لا يصعد فقاعات الهواء في الماء؟ إن لم يكن في الغرفة تتسرب منها المياه. - إغلاق الصمامات لثلاث ثوان تقريبا.
- رصد تحركات اليرقات المتبقية في المجهر. الاختيار على كل من نبضات القلب وحركات العضلات. إذا لزم الأمر فتح وإغلاق الصمامات كما هو موضح في الخطوة 8 و 9 من التخدير حتى اليرقة كاملة ، ثم إغلاق كافة الصمامات وبدء التصوير.
يرجى التحقق على هذه الخطوة :
بقايا حركة العضلات أو نبضات يشير إلى أن اليرقة ليس تخدير بشكل صحيح. التخدير الكامل هو حيوي بالنسبة للصور عالية الدقة. ينبغي أن لا تكون عادة اليرقة تخدير لمدة أطول من 15-20 دقيقة في وقت معين.
C) التصوير
- تحديد الموضع الصحيح وصورة لهيكل الفوائد (الشكل 2-4).
D) والشفاء من التخدير
- بعد اكتمال التصوير تدع الهواء داخل الغرفة.
يرجى التحقق على هذه الخطوة :
التحقق من نبضات القلب وانقباض العضلات اليرقة بواسطة ضوء الهالوجين المنقولة. كما تبدأ العضلات المتعاقدة أنها آمنة لإزالة اليرقات من غرفة التصوير. - فصل غرفة من الجهاز التخدير وإزالته من المجهر. تفكيك الغرفة بعناية ووضع يرقة ذبابة المتوسط المهروسة في الزراعة.
- مخزن الطبق في حاضنة على درجة حرارة مناسبة.
E) سلسلة من الزمن
- كرر الخطوات 2-14 حتى تم الحصول على النقاط وقتا كافيا.
بروتوكول بديلة :
إذا كان هو يرقة يمكن تصوير أكثر من مرة خلال فترة 30 دقيقة قد يكون من العملي أن يترك في غرفة التصوير حتى نقطة التخدير في المرة القادمة. كرر الخطوات 7-14 حتى تم الحصول على النقاط وقتا كافيا.
يرجى التحقق على هذه الخطوة :
ليس اليرقة إلى أن يوضع في غرفة التصوير لأكثر من ساعتين في وقت واحد ، ولا أن يكون تخدير لمدة أطول من 15-20 دقيقة في المرة الواحدة.
الشكل 1 الجمعية العامة للغرفة التصوير. (A) مكان اليرقة وهل البلاستيك على طبقة النفط. (ب) ضع 22 × 22 مم زلة تغطية على هل وإدراج دليل خاتم زجاجي في غرفة ، بجانب (C) تحديد موقف اليرقة مع حلقة معدنية و (د) إغلاق الغرفة. (E) والآن الغرفة على استعداد لتركيبها على المجهر.
الشكل 2 جسم الجدار يرقات ذبابة الفاكهة في العضلات. والعضلات والتي تصور NMJs تعبيرا عن انصهار بروتين CD8 - 8 - SH GFP. يتم عرض العضلات كما لوحظ عند التركيز على الجانب البطني من خلال جليدة في اليرقة. في (AC) هو مبين في العضلة الأكثر سطحية ، و 27 ، في عضلات (KL) معظم الداخلية و 6 و 7 ، وترد. جدول المحامين : 100 ميكرون ، ΔZ بين شرائح هو 2 ميكرون.
الشكل 3 هوية الجسم العضلات في جدار يرقات ذبابة الفاكهة. يظهر هوية يرقات ذبابة الفاكهة في عضلات L3 ، الجزء A3. والعضلات والتي تصور NMJs تعبيرا عن انصهار بروتين CD8 - 8 - SH GFP. يتم عرض العضلات كما لوحظ عند التركيز على الجانب البطني من خلال جليدة في اليرقات. ميلان هو مبين في العضلات أكثر سطحية ، و 27 ، في معظم عضلات KL الداخلية و 6 و 7 ، وترد. شريط مقياس : 100 ميكرون ، ΔZ بين شرائح هو 2 ميكرون.
الشكل 4 تقاطعات هوية يرقات ذبابة الفاكهة العصبية والعضلية. (م) والتي تصور NMJs التعبير عن بروتين الانصهار DGluRIIA mRFP - 1. يتم عرض NMJs كما لوحظ عند التركيز على الجانب البطني من خلال جليدة في اليرقة. في NMJ على (AB) الأكثر سطحية ، و 27 ، ويرد ، في مؤتمر نزع السلاح وأظهرت معظم NMJs الداخلية و 6 و 7. شريط مقياس : 100 ميكرون ، ΔZ بين شرائح هي 5 ميكرون. (E) و (F) وتعطى هوية NMJs (F) سطحية (E) والداخلية أكثر كمرجع.
Discussion
وقد وضعت في البداية قدم طريقة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic على عضلات جدار الجسم يرقات ذبابة الفاكهة melanogaster. تتميز ذبابة الفاكهة تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) من قبل المعمارية خلوي النمطية للعضلات والاعصاب وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للتصوير في الجسم الحي. ومع ذلك ، لا يقتصر على وصف لبروتوكول التخدير التصوير NMJ ؛ شفافية يرقات ذبابة الفاكهة يسهل التكيف التابع لبروتوكول وصف لدراسة تطوير الأجهزة ، والهجرة من الخلايا ، ونقل البضائع وإعادة التنظيم المحاور الفرعية الخلوية داخل الخلايا.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر Schönle اندرياس ، ماكس بلانك ، ، معهد الكيمياء والفيزياء الحيوية وألمانيا وديفيد ساندستروم J. ، المعهد الوطني للصحة العقلية ، المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية للحصول على المشورة التقنية. نشكر فرانك Kötting ، المعهد الأوروبي لعلم الأعصاب ، غوتينغن لبناء غرفة التصوير وجهاز تخدير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مبادرة الإضافية اطلعوا على الزهايمر TMRYZ أيده زمالة من مجلس المنح الدراسية الصينية ، SBH بواسطة الزمالة من كلية الدراسات العليا للعلوم الأعصاب الخلوية والجزيئية في جامعة توبنغن.
Materials
Reagents:
Equipment:
|
References
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , Georg-August-University Göttingen. (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &, Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
