Summary
이 프로토콜은 그대로의 anesthetization 및 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다
Abstract
원하는 유전자 변형 동물 라인의 효율적인 설립을 허용 광학 이미징, 유전자 인코딩 fluorophores과 유전 도구에 최근 개선은 생물 학적 과정은 생활의 맥락에서 연구되고 활성화하고, 어떤 경우에는 심지어, 유기체 행동했습니다. 이 프로토콜에서는 하위 세포 해상도 1-3에서 시냅스 인구의 개발과 소성에 따라 desflurane 휘발성 마취제를 사용하여 손상 Drosophila의 애벌레를 마취하는 방법을 설명합니다. Drosophila melanogaster의 애벌레를 마취 다른 유용한 방법은 이전에 4,5,6,7,8를 설명했습니다 있지만, 여기에 표시되는 프로토콜은 다음과 같은 조합 주요 기능으로 인해 상당한 개선을 보여줍니다 anesthetization (1) 매우 높은 학위를,도 심장 박동은 일 2 (몇 시간의 기간 동안 개 이상의 시간 점의 녹음을 허락 anesthetization 사이클 당> 90 % (2) 높은 생존율, 최대 150 nm의 1 수평 해상도에 대한 허용 체포 3)이 경우에 우리를 가능하게 높은 민감도는 생리적 수준에서 표현 단백질의 역학을 연구합니다. 세부, 우리는 GluR - IIA 안정 트렌스 제닉 라인에서 내생 모터 1 엑슨 트랩 라인 FasII - GFP 하나를 통해 표현 postsynaptic 글루 탐 산염 수용체 subunit을 시각화 수 있었다. (4) 다른 방법과는 달리 4,7 애벌레가 아니라 살아있는 몇 군데 아니라 손상 수 있습니다 (즉, 비 해부) 관찰은 일 1 숫자를 통해 발생하는 수. 함께 비디오 내용을 생체내 이미징 챔버 2,3에있는 개별 부품의 기능, 애벌레, anesthetization 절차, 방법 유충 내의 특정 위치를 다시 확인하고 애벌레의 안전한 제거 장착 올바른 이미징에서 챔버.
Protocol
이미지 챔버의) 조립
- 선택한 단계 (25에서 약 24 시간의 관찰 간격을두고 ° C를 무대를 방황까지 예 초기 제 3 instar의 애벌레)의 유충을 선택합니다.
- 문화 매체와 지문이 건조의 그것을 깨끗한 물을 가진 유충을 씻어.
- 할로 카본 오일 박막과 챔버의 바닥 요소 유충을 얼굴 영역의 중심 문장.
- 챔버에서 현미경 목표가 직면하고있는 복부 측면과 유충을 넣어 것은 (신경근육학 교차로 (NMJ) 26 27이 몇 군데있을 수 있습니다) (그림 1 AE).
- 그리드 얼굴 위쪽 (그림 1)의 공기 슬롯과 오일 층에 플라스틱 스페이서를 놓습니다. 이 단계에서 확인하시기 바랍니다 스페이서의 높이가 약 절반 애벌레 직경이며, 슬릿의 너비가 유충 약 두 배 직경해야합니다.
- 현미경에 이미지 챔버를 배치
유충의 B) Anesthetization
- 적절한 anesthetization 장치 / 기화기와 챔버의 두 인레츠를 연결합니다.
최대 - 프런트를 확인하십시오 :
룸 공기 desflurane의 효과적인 농도는 안전 규정에 의해 지정된을 초과하지 않습니다! desflurane만이 매우 작은 총 볼륨은 애벌레를 마취하기 위해 필요합니다. desflurane 1 15 %의 응용 프로그램 (V / V)는 실험에 사용되는 이상적인 농도를 결정하기위한 좋은 출발점이 될 입증되었습니다. 안전상의 이유로 우리는 기화기가 생체내 이미징에의 2~4시간에 필요한 것보다 더 desflurane이 포함해서는 안하는 것이 좋습니다. - 물 한 잔에서 챔버 콘센트에 연결된 튜브의 다른 쪽 끝을 담가 후 약 5 초 동안 챔버에 마취의 흐름을 제어하는 밸브를 엽니다.
이 단계에서 확인하십시오 :
공기 방울이 물속에 올라가나요? 그렇지 않다면 챔버 새는입니다. - 약 3 초 동안 밸브를 닫습니다.
- 현미경에 잔류 애벌레 움직임을 모니터링합니다. 심장 박동과 근육의 움직임을 모두 확인하십시오. 유충의 anesthetization가 완료될 때까지 필요한 열고 닫는 밸브로 8 단계 9에서 설명한다면, 모든 밸브를 닫고 이미지를 시작합니다.
이 단계에서 확인하십시오 :
잔여 근육의 움직임이나 심장 박동이 유충이 제대로 anesthetized되지 않았음을 나타냅니다. 완료 anesthetization는 고해상도 이미지를 매우 중요합니다. 유충은 일반적으로 주어진 시간에 더 이상보다 15-20분에 대한 anesthetized되지 않습니다.
C) 이미징
- 올바른 위치와 이미지를 관심의 구조 (그림 2-4)을 식별합니다.
anesthetization에서 D) 복구
- 영상은 챔버에 공기를하게 완료되면.
이 단계에서 확인하십시오 :
전송 할로겐 라이트에 의해 유충의 심장 박동과 근육의 수축을 확인하십시오. 근육이 계약을 시작으로 그것은 이미징 챔버에서 유충을 제거하는 것이 안전합니다. - anesthetization 장치에서 챔버를 분리하여 현미경에서 제거합니다. 자세히 챔버를 분해하고 으깬 플라이 재배 매체의 유충을 놓으십시오.
- 적절한 온도에서 인큐베이터에있는 요리를 보관합니다.
E) 시간 시리즈
- 충분한 시간이 포인트를 얻을 때까지 단계 2-14을 반복합니다.
대체 프로토콜 :
유충은 30 분 간격 내에서 두 번 이상 군데되어야하는 경우는 다음 anesthetization의 시점까지 이미징 챔버에 나가 실질적인 수도 있습니다. 충분한 시간이 포인트를 얻을 때까지 단계 7-14을 반복합니다.
이 단계에서 확인하십시오 :
유충은 한 번에 두 개 이상의 시간 동안 이미징 챔버에 보관하거나 그것이 한 번에 15-20분 이상에 대한 anesthetized되어야하는 수 없습니다.
이미지 챔버 1 조립 그림. (A) 오일 층에 유충과 플라스틱 스페이서를 놓습니다. (B) 공백에 22 X 22mm 커버 슬립을 플레이스와 (C) 금속 고리와 유충의 위치를 수정하고 (D) 챔버를 닫습니다 다음, 챔버에 플렉시 가이드 반지를 삽입합니다. (E) 이제 챔버는 현미경에 장착할 준비가 된 것입니다.
Drosophila의 애벌레 2 바디 - 벽의 근육을 그림. 근육과 NMJs는 CD8 - GFP - sh을 융합 단백질 8 표현으로 시각했다. 유충으로 표피를 통해 복부 측면에 초점을 때 관찰로 근육이 표시됩니다. 년 (AC)가 가장 높은 표면 근육, 27, 표시됩니다 (KL)가 가장 높은 내부 근육, 6과 7에 표시됩니다. 스케일 바 : 100 μm의, 조각 사이 ΔZ 2 μm의 수 있습니다.
Drosophila의 애벌레의 몸 - 벽의 근육 3 ID를 그림. L3 Drosophila의 애벌레, 세그먼트 A3에서 근육의 신분이 표시됩니다. 근육과 NMJs는 CD8 - GFP - sh을 융합 단백질 8 표현으로 시각했다. 애벌레로 표피를 통해 복부 측면에 초점을 때 관찰로 근육이 표시됩니다. AC에서 가장 피상적인 근육, 27, 같습니다, KL 가장 내부 근육, 6과 7에 표시됩니다. 스케일 바 : 100 μm의, ΔZ 조각 사이에 2 μm의 수 있습니다.
그림 Drosophila의 애벌레의 신경근육학 분기점 4 정체성. (AD) NMJs는 DGluRIIA - mRFP 융합 단백질 1 표현으로 시각했다. 유충으로 표피를 통해 복부 측면에 초점을 때 관찰로 NMJs가 표시됩니다. (AB)가 가장 높은 표면 NMJ, 27에 표시됩니다, CD에서 가장 인테리어 NMJs, 6과 7이 표시됩니다. 스케일 바 : 100 μm의, ΔZ 조각 사이에 5 μm의 수 있습니다. (E)와 (F) 표면 (E)보다 내부 (F) NMJs의 신원을 참조 주어집니다.
Discussion
제출 방법은 처음 Drosophila melanogaster의 애벌레의 본문 벽의 근육에 glutamatergic 시냅스를 공부하기 위해 개발되었습니다. Drosophila 신경근육학 교차로 (NMJ)은 근육과 신경의 틀에 박힌 cyto 아키텍처가 특징이며, 따라서 이상적인 생체내 이미징에 적합합니다. 그러나, 설명 anesthetization 프로토콜은 이미징 NMJ에 국한되지, Drosophila의 애벌레의 투명성은 장기의 개발 연구를 설명하는 프로토콜의 적응, 세포의 마이 그 레이션, 세포 내에서 axonal화물과 하위 세포 조직 개편의 수송을 용이하게합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 안드레아스 Schönle, Biophysical 화학, 독일, 데이비드 J. 샌드 스트롬, 정신 건강의 국립 연구소, 기술적인 조언 건강, 베데스다, MD, 미국의 국립 연구소에 대한 최대 - 플랭크 - 연구소 주셔서 감사합니다. 우리는 프랭크 Kötting, 유럽 신경 과학 연구소, 이미징 챔버 구축을위한 괴팅겐과 anesthetization 장치를 주셔서 감사합니다. 이 작업이 TMRYZ에 알츠하이머 Forschung 이니셔티브에서 교부금에 의해 지원되었고 세포 및 분자 신경 과학, 튀빙겐 대학교에 대한 대학원의 화목에 의해 중국 장학 협의회, SBH의 화목에 의해 지원되었다.
Materials
Reagents:
Equipment:
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References
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