Summary
Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de intacta
Abstract
Recentes melhorias na imagem óptica, fluoróforos geneticamente codificados e ferramentas genéticas que permite criação eficiente de linhas desejado animal transgênico permitiram processos biológicos a ser estudada no contexto de uma vida, e em alguns casos, mesmo comportando, organismo. Neste protocolo, vamos descrever como para anestesiar as larvas Drosophila intactas, utilizando o anestésico volátil desflurano, para acompanhar o desenvolvimento e plasticidade sináptica das populações a nível sub-celular Resolução 03/01. Enquanto outros métodos úteis para anestesiar Drosophila melanogaster larvas foram descritos anteriormente 4,5,6,7,8, o protocolo aqui apresentado demonstra melhorias significativas devido ao seguinte combinado principais características: (1) Um grau muito elevado de anestesiados, mesmo os batimento cardíaco é preso permitindo a resolução lateral de até 150 nm 1, (2) uma elevada taxa de sobrevivência de> 90% por ciclo anestesiados, que permitem a gravação de mais de cinco pontos temporais durante um período de horas ou dias 2 e ( 3) uma alta sensibilidade permitindo-nos em duas instâncias para estudar a dinâmica de proteínas expressas em níveis fisiológicos. No detalhe, nós fomos capazes de visualizar a subunidade do receptor pós-sináptico de glutamato GluR-IIA expressas por meio do promotor endógeno 1 em linhagens transgênicas e estável da linha de armadilha exon FasII GFP-1. (4) Em contraste com outros métodos 4,7 larvas pode ser trabalhada não apenas vivo, mas também intactos (ou seja, não dissecado), permitindo a observação de ocorrer ao longo de vários dias 1. Os detalhes de vídeo que acompanha a função de partes individuais do in vivo de imagens da câmara 2,3, a correta montagem das larvas, o procedimento anestesiados, como re-identificação de posições específicas dentro de uma larva ea remoção segura das larvas a partir da imagem câmara.
Protocol
A) Assembleia da câmara de imagens
- Selecione uma larva de estágio escolhido (por exemplo, no início 3 de larvas deixando um intervalo de observação de cerca de 24 horas a 25 ° C até vagando palco).
- Lavar a larva com água para limpá-lo do meio de cultura e DAB-lo seco.
- Brasão centro do elemento inferior da câmara, da região para enfrentar a larva, com uma fina película de óleo de halocarbonos.
- Coloque a larva com o lado ventral de frente para a objetiva do microscópio na câmara (permite junção neuromuscular (MNJ) 26 e 27 a ser trabalhada) (Figura 1 AE).
- Coloque o espaçador de plástico para a camada de petróleo, com as aberturas de ar do para cima da grade face (Figura 1 A). Por favor verifique nesta etapa: A altura do espaçador é aproximadamente metade do diâmetro larval, a largura da fenda deve ser cerca de duas vezes o diâmetro da larva.
- Coloque a câmara de imagem no microscópio
B) anestesiados da larva
- Conectar as duas entradas da câmara com um dispositivo apropriado anestesiados / vaporizador.
Por favor, verifique na frente:
A concentração eficaz de desflurano na sala com ar nunca deve exceder a especificada pelas normas de segurança! Apenas um volume muito pequeno total de desflurano é necessária para anestesiar as larvas. A aplicação de 15% (v / v) de 1 desflurano tem provado ser um bom ponto de partida para determinar a concentração ideal para ser usado em um experimento. Por razões de segurança, sugerimos que o vaporizador não deve conter mais do que o necessário desflurano para 2-4 horas de imagens em vivo. - Mergulhe a outra extremidade do tubo ligado à saída da câmara em um copo de água em seguida, abra as válvulas de controle do fluxo do anestésico na câmara durante cerca de cinco segundos.
Por favor verifique nesta etapa:
Fazer bolhas de ar sobem na água? Se não for a câmara está com vazamento. - Fechar as válvulas por cerca de três segundos.
- Monitorar residual movimentos larval no microscópio. Verifique tanto o batimento cardíaco e movimentos musculares. Se for necessário abrir e fechar válvulas, tal como descrito no passo 8 e 9 até anestesiados da larva é completa, em seguida, feche todas as válvulas e começar de imagem.
Por favor verifique nesta etapa:
Movimento muscular residual ou batimentos cardíacos indica que a larva não está devidamente anestesiados. Anestesiados completo é vital para imagens em alta resolução. A larva não deve normalmente ser anestesiado por mais de 15-20 minutos em um determinado momento.
C) Imaging
- Identificar a posição correta e imagem da estrutura de interesse (Figura 2-4).
D) Recuperação de anestesiados
- Depois de imagem é completada deixar o ar na câmara.
Por favor verifique nesta etapa:
Verifique batimentos cardíacos e contrações musculares da larva por luz halógena transmitida. Como os músculos começam a contratação é seguro para remover a larva da câmara de imagem. - Retire a câmara do dispositivo anestesiados e removê-lo do microscópio. Desmonte a câmara com cuidado e coloque o purê de larva em meio de cultivo voar.
- Guarde o prato em uma incubadora à temperatura adequada.
E) de séries temporais
- Repita a 14/02 passos até os pontos de tempo suficiente ter sido obtidos.
Alternativa protocolo:
Se a larva é para ser fotografada mais de uma vez dentro de um intervalo de 30 minutos pode ser prático para deixá-lo na câmara de imagem até o próximo ponto anestesiados tempo. Repita a 14/07 passos até os pontos de tempo suficiente ter sido obtidos.
Por favor verifique nesta etapa:
A larva não é para ser mantida na câmara de imagem por mais de duas horas em um momento, nem é para ser anestesiado por mais de 15-20 minutos de cada vez.
Figura 1 Montagem da câmara de imagem. (A) Coloque a larva eo espaçador de plástico para a camada de óleo. (B) Coloque um 22 x 22 mm em lamínula o espaçador e inserir o anel de guia para a câmara de plexiglas, next (C) corrigir a posição da larva com o anel de metal e (D) fechar a câmara. (E) Agora a câmara está pronta para ser montado no microscópio.
Figura 2 Corpo parede músculos em larvas de Drosophila. Músculos e NMJs foram visualizados por expressão de uma proteína de fusão GFP-CD8-Sh 8. Os músculos são mostradas como se observa quando o foco no lado ventral através da cutícula para a larva. In (AC) o músculo mais superficial, 27, é mostrado, em (KL) os músculos mais interiores, 6 e 7, são mostrados. Bar escala: 100 mM, ΔZ entre fatias é 2 m.
Figura 3 Identidade do corpo na parede músculos em larvas de Drosophila. A identidade dos músculos em larvas L3 Drosophila, A3 segmento, é mostrado. Músculos e NMJs foram visualizados por expressão de uma proteína de fusão GFP-CD8-Sh 8. Os músculos são exibidos como se observa quando o foco no lado ventral através da cutícula para as larvas. Na AC o músculo mais superficial, 27, é mostrado, em KL os músculos mais interiores, 6 e 7, são mostrados. Bar escala: 100 mm, ΔZ entre fatias é 2 m.
Figura 4 Identidade de junções neuromusculares de larvas de Drosophila. (AD) NMJs foram visualizados por expressão de uma proteína de fusão DGluRIIA-MRFP 1. O NMJs são mostrados como se observa quando o foco no lado ventral através da cutícula para a larva. Em (AB), o MNJ mais superficial, 27, é mostrado, no CD do NMJs mais interior, 6 e 7, são mostrados. Bar escala: 100 mm, ΔZ entre fatias é 5 mm. (E) e (F) a identidade do superficial (E) e mais interior (F) NMJs é dada como referência.
Discussion
O método apresentado foi desenvolvido inicialmente para estudar sinapses glutamatérgicas sobre os músculos do corpo muro de Drosophila melanogaster larvas. A Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é caracterizada por um estereótipo cito-arquitetura dos músculos e neurônios e é, portanto, ideal para a imagem in vivo. No entanto, o protocolo descrito anestesiados não se limita à imagem do MNJ; a transparência de larvas de Drosophila facilita a adaptação do protocolo descrito para estudar o desenvolvimento de órgãos, a migração de células, transporte de carga axonal e sub-celular de reorganização dentro das células.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Andreas Schönle, Max Plank Institute, para Química Biofísica, Alemanha e David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA, para assessoria técnica. Agradecemos a Frank Kötting, European Neuroscience Institute, Göttingen para a construção da câmara de imagem eo dispositivo anestesiados. Este trabalho foi financiado por concessões do Forschung Alzheimer Iniciativa para TMRYZ foi apoiado por uma bolsa da China Scholarship Conselho, SBH por uma bolsa de estudos da Escola de Pós-Graduação em Neurociência Celular e Molecular, Universidade de Tübingen.
Materials
Reagents:
Equipment:
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References
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