Summary
العديد من الإصابات استثارة رد فعل قوي CTL ، ولكن في بعض الأحيان ، وكمية من الخلايا لا ترتبط الاستجابة لمكافحة مسببات المرض
Abstract
ويمكن استخدام Carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFSE) بسهولة وبسرعة تسمية السكان الخلية التي تهم التحقيق في الجسم الحي. وتقليديا كانت هذه العلامات تستخدم لدراسة انتشار الأسلحة النووية والهجرة. في أسلوب المعروضة هنا ، ونحن تقصير الفترة الزمنية بعد نقل بالتبني للنظر في البقاء على قيد الحياة وقتل الخلايا حاتمة CFSE محددة الهدف المسمى 4-6. يمكن لمستوى معين من قتل استنساخ الخلية CD8 + T تشير إلى نوعية الاستجابة ، وكميتها قد يكون مضللا. محددة CD8 + الخلايا التائية يمكن أن تصبح مع مرور الوقت استنفدت وظيفيا مع انخفاض في الانتاج خلوى وقتل 7،8. أيضا ، قد بعض الخلايا التائية CD8 + لا تقتل الحيوانات المستنسخة فضلا عن غيرهم مع اختلاف الخصائص TCR 9. لفعالية الخلية الحصانة ساطة (CMI) ، يجب تحديد المستضدات التي تنتج ليس فقط أعدادا كافية للاستجابة خلايا تي ، ولكن أيضا قوية وظيفيا خلايا تي الاستجابة. هنا نقيم قتل خلايا محددة في المئة من اثنين من الببتيد محددة استنساخ خلايا تي في BALB / ج الفئران.
Protocol
1. انتزاع محددة الهدف CTLs المستجيب عن طريق التحصين (يوم 0)
- قبل البدء ، أن يقرر بناء على المستجيب معينة : النظام الهدف. في هذا المثال من الكلاسيكية في مقايسة CTL الحية ، وسوف نستخدم التحصين الببتيد المنقى لانتزاع محددة CD8 + T الخلايا. وسيتم استخدام نفس الببتيد لنبض الخلايا المستهدفة مسانج ، وخلق المستجيب محددة هي : النظام الهدف. بدلا من ذلك ، قد اخترت استخدام الممرض كليا أو الحصول على البروتين الخاص المستجيبات وأهداف محددة.
- تطهير داخل سطح العمل من غطاء لضمان السلامة البيولوجية للعقم عن طريق الحقن. تحضير التحصين الببتيد من جانب أول من وضع 50 ميكروغرام في تنقية الببتيد DMSO ميكرولتر 100 10 ٪ في برنامج تلفزيوني / الماوس الواردة في أنبوب مل 2. المقبل ، إضافة مبلغ مساو من شدة البرد المصاحب فرويند غير كاملة وتصل إلى علامة 0.2 مل مع حبات 1 ملم للخلط. من هذه النقطة ، والحفاظ على الجليد حتى مستمنع الحقن. تأمين غطاء مع Parafilm.
- استخدام حبة الخافق لتعيين الحد الأقصى اللفات في الدقيقة لخلط المستحلب لمدة 3 دقائق ، ووضع على الفور مستحلب مرة أخرى على الجليد بعد الاختلاط. ينبغي أن يكون مستحلب الناتجة مماثلة في تناسق لالمايونيز. مستحلب تسمح للجلوس على 4 درجات مئوية خلال الليل اذا سمح الوقت (تصل الى اسبوع) ، والخلط كذلك إذا لاحظت أي انفصال.
- استخدام حقنة 1 مل و 20 أو 20.5 إبرة قياس لسحب ما يصل مستحلب الحرص على عدم سحب ما يصل أي الخرز (حبات يجب أن تكون أكبر من مقياس للإبرة ، ولكن لا يزال على علم).
- تأمين الماوس للحقن تحت الجلد عند قاعدة الذيل. نستخدم تعديل أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل المخروطية بأمان وبلطف لشل حركة الماوس للحقن. حقن الفأر مع 0.2 مل من مستحلب.
2. حصاد الخلايا المستهدفة (اليوم 8)
- ستحتاج الفئران مسانج ساذجة للخلايا التي تستهدفها. الموت ببطء الفئران السذاجة وفقا للمعايير AAALAC.
- تطهير الماوس عن طريق الرش الإيثانول 70 ٪ لتقليل فرصة حدوث تلوث من الشعر الماوس أو ملوثات أخرى خارجية.
- باستخدام مقص تشريح جعل القصاصة الصغيرة من خلال الجلد في الجانب الأيسر من الماوس. سحب رفرف فوق الجلد لكشف الكيس البريتوني والأعضاء الداخلية.
- قصاصة من خلال الصفاق ، والحرص على عدم استبعاد أي من الأجهزة الأساسية. والطحال ، على مقربة من السطح والذي يشبه في اللون للكبد (أحمر غامق) ولكن أصغر حجما وأكثر اللوبيا في الشكل. الفئران المصابة تظهر عادة الطحال أكبر ولا سيما من الضوابط غير المصابة.
- سحب بعناية والطحال ، مع الحرص على أن يكون لطيف حتى لا تكسر الطحال في أجزاء متعددة من أجل استرداد أعداد الخلايا الأقصى. المكان على الفور والطحال في 15 مليلتر المخروطية التي تحتوي على 10 ملل من وسائل الإعلام على استعداد على الجليد. تواصل مع الفئران المتبقية.
- صب محتويات أنبوب مخروطي 15 مل (وسائل الإعلام والطحال) في الزجاج طاحونة الأنسجة. طحن الطحال به الكثير من قوة الذراع. عندما تكون جميع الأنسجة قد فقدت لونها قد افترض أن لديك استرداد كافة الخلايا من النسيج الضام.
- صب محتويات طاحونة من خلال تصفية 70 ميكرومتر الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل. شطف طاحونة جديدة مع وسائل الاعلام ويسكب من خلال مصفاة الخلية.
- الطرد المركزي في 4 درجات مئوية ، 1300 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق. تخلصي طاف.
- Resuspend في 10 مليليتر من كاشف lysing إعداد واحتضان على 37 درجة لمدة 7 دقائق.
- تضيف ما يصل الى 50 ملل مع وسائل الإعلام الجديدة وأجهزة الطرد المركزي ، مثلما ورد أعلاه.
- Resuspend 50 مليليتر في وسائل الإعلام الجديدة وأجهزة الطرد المركزي ، مثلما ورد اعلاه (الخطوة غسل). * ملاحظة : في هذا الوقت يمكنك تنفيذ الفصل المغناطيسي للخلية خلية نوع معين (أي الضامة) إذا كان المطلوب هو محض السكان الخلية المستهدفة لنقل المتلقي في الفئران. أيضا ، في هذا الوقت يمكن أن أعرض لكم علاجا تجريبيا في الثقافة ، من أجل دراسة ويؤثر هذا العلاج على قتل خلايا محددة.
- عدد الخلايا ولوحة 1 × 10 7 لكل بئر في 100μL في 96 لوحة الأنسجة أسفل الجولة جيدا ثقافة المعالجة. * هذا هو تركيز عال من الخلايا / جيد ، ولكن لأن الفحص هو واحد سريع ، ونحن لم نر أي خسارة في بقاء الخلايا على هذا التركيز.
3. العلاج وصفها من الخلايا المستهدفة
- نبض الخلايا المناسبة ويتطابق مع الممرض الببتيد محددة أو غير ذات صلة السيطرة الببتيد : إضافة 1 ميكروغرام / مل الببتيد. في احتضان 4 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. الانتقال إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حاضنة الماضي. خلال هذا الوقت يعد كاشف CFSE.
- إعداد CFSE وفقا لمواصفات الشركة المصنعة وتمييع لتركيز العمل ما بين 0.5 و 25 ميكرومتر. جعل "منخفضة" تركيز أقل من 10X "عالية" CFSE التركيز. على سبيل المثال ، [منخفض] إضافة إلى 0.5 CFSE ميكرولتر PBS تراخيص ل10 و [ارتفاع] ، إضافة إلى 5 CFSE ميكرولتر PBS 10 مليليتر. CFSE أعد الدافئة إلى 37 درجة مئوية قبل وضع العلامات.
- إزالة لوحة من الخلايا من الحاضنة وعellet في أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية في درجة حرارة الغرفة ، 1300 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق. نفض الغبار لإزالة طاف.
- Resuspend الخلايا في إما [منخفض] جيم [عالية] CFSE بإضافة 200 ميكرولتر من كاشف المناسبة للآبار المناظرة واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة أو
- إزالة لوحة من الخلايا من الحاضنة وبيليه مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة ، 1300 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق. نفض الغبار لإزالة طاف.
- Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر / جيد من وسائل الإعلام الجديدة وتحسنت احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة لوحة من الخلايا من الحاضنة وبيليه في درجة حرارة الغرفة ، 1300 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق. نفض الغبار لإزالة طاف.
- Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني ميكرولتر / جيد 100.
- لنقل بالتبني ، إضافة بئر واحدة [منخفض] الخلايا المسمى واحد جيدا [عالية] المسماة الخلايا في الماوس. وينبغي أن يؤدي حقن أهداف محددة 50 ٪ و 50 ٪ غير ذات صلة الخلايا في 0.2 مليليتر.
- لا تنس أن جانبا بعض الخلايا المسمى لتكون بمثابة التحكم الخاصة بك غير المنقولة خلال تحليل البيانات وتعمل على تدفق عداد الكريات (أنظر الشكل 1).
4. نقل بالتبني
- تخدير الفئران الببتيد سبق تحصينهم (من الجزء رقم 1 من هذا البروتوكول) وفقا للمعايير AAALAC.
- ضخ 0.2 مليليتر من الخلايا المستهدفة المسمى عبر الطريق المداري الرجعية في الفئران المتلقية.
- الانتظار 6 ساعات أو غيرها من الوقت الأمثل سلفا قبل euthanizing الفئران المتلقية.
5. حصاد خلايا إعتبر
* ملاحظة : خطوات 5.1 خلال 5.11 هي نفس الخطوات 2.1 خلال 2.11
- عدد الخلايا وطبق بها في 1 × 10 6 لكل بئر في 100 ميليلتر في 96 جولة جيدا أسفل زراعة الأنسجة لوحة المعالجة.
- إصلاح الخلايا تعافى وغير المنقولة ، وذلك بإضافة 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 2 ٪ إلى التركيز النهائي للبارافورمالدهيد 1 ٪ لجميع الآبار.
6. التدفق الخلوي وتحليل البيانات
- تشغيل العينات على تدفق عداد الكريات وتحليل البيانات.
7. ممثل النتائج
ذروة حاتمة تناقص محددة على الرسم البياني مما يعد مؤشرا على قتل خلايا محددة (الشكل 1). استخدام المعادلات التالية (المطبقة في الجدول رقم 1) لتحديد القيمة الفعلية للتحلل خلايا محددة :
النسبة المئوية = ذي صلة : النسبة المئوية المحددة حاتمة (الذروة [منخفض] : [عالية] الذروة) ،
تحلل في المئة محددة = [1 -- (عدم نقل السيطرة نسبة / نسبة التجريبي)] × 100
الشكل 1. ملف CFSE أرقام تعافى splenocytes الماوس BALB / ج. تبين النسبة المئوية للخلايا النمط الظاهري CFSE مرتفعة أو منخفضة. أ) عدم نقل السيطرة. كل [عالية] CFSE قمم تمثل حاتمة الخلايا المستهدفة المحددة ، في حين CFSE [منخفض] قمم تمثل أهدافا نابض مع الببتيد غير ذي صلة. ب) الخلايا CFSE المسمى تعافى من الماوس PBS تحصين المتلقي (مراقبة). ج) خلايا CFSE المسمى تعافى من اثنين من الفئران الببتيد المتلقي محددة مختلفة ، لاحظ تقلص القمم حاتمة محددة.
الشكل 2. تمثيل رسومي للبيانات التي تم تحليلها. ثلاث نقاط بيانات أظهرت لكل مجموعة من الفئران ، وبرنامج تلفزيوني ، الببتيد ألف ، وباء الببتيد
| عينة | نابض حاتمة CFSE ٪ HIGH | ٪ CFSE LOW غير ذات الصلة | نسبة قليلة : السامي | قتل محددة في المئة حاتمة |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| الببتيد A | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| الببتيد A | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| الببتيد A | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| الببتيد B | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| الببتيد B | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| الببتيد B | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NT التحكم | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| بيب تحكم NT | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| بيب B NT التحكم | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
الجدول 1. تحليل بيانات تمثيلية ". NT" غير قابلة للنقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تعديل هذا الاختبار للتحقق من قدرة التكاثري من الخلايا ، بما في ذلك التوسع نسيلي ، لأن يقسم بالتساوي CFSE نسبيا بين 10،11 ذرية. ومن الممكن أيضا استخدام العلامات CFSE الهجرة للتحقيق في الخلية 6،12 ، وإن كانت هناك خلية أخرى تتبع الأساليب التي قد تكون أكثر ملائمة اعتمادا على فرضية الخاص ، على سبيل المثال tetramers وتلألؤ بيولوجي 13 ، والتي أيضا قد تكون جنبا إلى جنب مع وضع العلامات CFSE.
ومن المهم أن نلاحظ أن ينزف أكثر من CFSE إلى قنوات متعددة على تدفق عداد الكريات ، لذلك إذا كنت تريد لعلامة السطح المشترك وصمة عار ، وPeCy7 يكون خيارا جيدا للfluorophore ، في حين أن المؤسسة العامة قد لا تعمل كذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح. وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة الاستخدام (IACUC) في جامعة ويسكونسن ماديسون.
Acknowledgments
وأود أن أشكر بيانكا MOTHE ، Oseroff كارلا ، وDelGuercio ماري فرنسا على عرضه لي أن المقايسات المناعية والتعامل مع الفأرة. ويتم تمويل عمل في مختبر الفاصل GA بواسطة منحة المعاهد الوطنية للصحة 1 - RO1 - AI - 073558 ، GLRCE منح U54 - 1 - AI - 057153 ، وبين الولايات المتحدة وBARD 3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
