Summary
许多感染引起强烈的CTL反应，但偶尔，响应细胞的数量不关联控制病原体
Abstract
羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于轻松快捷地标签为利息细胞在体内的调查人口。这种标签经典被用来研究细胞增殖和迁移。在这里介绍的方法，我们已经缩短继转移，寻找生存和杀害的抗原表位的具体CFSE标记的靶细胞4-6后的时间表。一个CD8 + T细胞克隆特异性杀伤水平可以表明质量的响应，其数量可能会误导。特异性CD8 + T细胞可以成为与细胞因子的产生和杀害7,8下降随时间的功能用尽。此外，某些CD8 + T细胞克隆可能不杀以及其他不同的TCR特异性9。有效的细胞免疫（CMI）的，必须确定抗原产生的反应性T细胞不仅数量充足，而且功能强大的反应性T细胞。在这里，我们评估的两个肽特异性T细胞克隆BALB / c小鼠的特异性杀伤细胞％。
Protocol
1。争取通过免疫目标特定效应的CTL（0天）
- 在开始之前，决定在某个特定的效应：目标系统。在这个经典的例子在体内 CTL的检测，我们将使用纯化肽的免疫接种，以诱导特异性CD8 + T细胞。脉同源的靶细胞，创建一个特定的效应：目标系统，将使用相同的肽。或者，您也可以选择使用整个病原体或蛋白质来获得您的具体效应和目标。
- 除污的工作表面内的一个生物安全罩，以确保注射的无菌。准备首先将50微克到100μL10％PBS /鼠标在2 mL试管中二甲基亚砜纯化肽肽的免疫接种。接下来，添加一个非常寒冷的不完全弗氏佐剂等量高达0.2毫升标记1毫米珠混合。从这一点来说，保持冰，直到注射的免疫原。安全盖的封口膜。
- 使用设置最大RPM的混合3分钟的乳液，及时放置在冰乳液混合后珠打浆机。由此产生的乳液应该是类似的一致性，以蛋黄酱。允许乳液坐于4 ° C过夜，如果时间允许（长达一个星期），搅拌进一步指出如果任何分离。
- 用1 ml注射器和针头20或20.5拉起乳液小心不要拉起任何珠（珠应大于针规，但仍然可以知道）。
- 安全鼠标为基地的尾巴皮下注射。我们使用一个改性塑料50 ml锥形管，安全和注射用鼠标轻轻固定。注入0.2毫升乳液鼠标。
2。收获靶细胞（8天）
- 您将需要为你的目标细胞的天真同基因小鼠。根据AAALAC标准安乐死天真的小鼠。
- 消毒，喷洒70％的乙醇，以尽量减少鼠标头发或其他外部污染物的污染的机会的鼠标。
- 使用夹层剪刀，通过皮肤上的鼠标左侧小剪断。将皮瓣，发现腹膜囊和内脏器官。
- 通过腹膜剪断，小心不要妥协任何底层的机关。脾脏是接近地表和颜色类似肝脏（暗红色），但体积更小，形状芸豆。感染小鼠的一般比未受感染的控制，特别是较大的脾脏。
- 小心地拉出脾，照顾要轻柔，以免打破成多个部分脾脏为了恢复最大的手机号码。在冰上，立即放入15毫升中含10 MLS准备媒体锥形脾。继续余下的小鼠。
- 倒入一个玻璃组织研磨机的15 mL锥形管（媒体和脾脏）的内容。研磨脾，使用大量的上臂力量。当所有的组织已经失去了它的颜色，你可以假设您已经收回了所有的结缔组织细胞。
- 通过一个70微米的细胞过滤器中倒入50 mL锥形管磨床的内容。冲洗与新媒体的磨床和倒通过细胞过滤器。
- 离心机在4 ° C，7分钟1300转。倒掉上清液。
- 悬浮在准备裂解试剂和孵育7分钟，在37 ° 10 MLS。
- 最多可添加50毫升新鲜的媒体和离心机，上面一样。
- 悬浮在50毫升新鲜媒体和离心机，与上面相同（洗一步）。 *注：此时，您可以执行一个特定的细胞类型的磁性细胞分离（即巨噬细胞），如果一个纯粹的靶细胞的人口转移到受体小鼠的理想。此外，在这个时候，你可以引入到文化的实验性治疗，以研究治疗，对细胞的特异性杀伤的影响。
- 在100μL数在96圆底组织文化对待板电池板1 × 10 7每口井。 *这是一种高浓度的细胞/孔，但因为检测是一种快速的，我们已经看到了在这个浓度的细胞的生存能力没有损失。
3。靶细胞的治疗和标签
- 脉冲适当的细胞和病原体的特异性多肽或无关的肽控制复制：添加1μg/ mL的肽。在4 ° C孵育1.5小时。最后30分钟，移至37℃培养箱。在这段时间内准备CFSE试剂。
- 根据制造商的规格准备CFSE和稀释到工作浓度为0.5和25微米之间。 “低”的浓度10倍比“高浓度CFSE较低。例如，[低]添加10毫升PBS 0.5μL，CFSE和[高]，加入5μL，CFSE 10毫升PBS。热身准备CFSE至37℃前的标签。
- 删除从孵化器和P细胞板ellet在室温条件下，7分钟1300转的高速离心机。弗里克去除上清液。
- 悬浮细胞要么[低]或[高] CFSE加入适当的试剂200μL相应的井和15分钟37 ° C。
- 卸下的孵化器，并再次颗粒细胞在室温下，7分钟1300转板。弗里克去除上清液。
- 悬浮细胞，在200μL/孔回暖的新媒体和孵育30分钟，在37 ° C。
- 卸下的孵化器和颗粒细胞在室温下，7分钟1300转板。弗里克去除上清液。
- 在100μL/孔PBS悬浮细胞。
- 继转移，添加一个[低]一个标记的细胞[高]标记每小鼠细胞。注射0.2毫升50％的具体目标和50％的不相关的细胞。
- 不要忘记预留一些标记的细胞行为在数据分析和流式细胞仪上运行的非转移的控制（见图1）。
4。继转移
- 麻醉以前肽免疫小鼠（从本协议的＃1一部分），根据AAALAC标准。
- 通过眼窝到受体小鼠的路线标记的靶细胞，注入0.2毫升。
- 等待euthanizing受体小鼠前6小时或其他预定的最佳时间。
5。收获标记的细胞
*注：步骤5.1通过5.11 2.1通过2.11的步骤相同
- 到96圆底组织培养处理板计数细胞和盘开出100μL1 × 10 6每口井。
- 加入100μL的2％多聚甲醛的终浓度为1％多聚甲醛，所有井修复细胞，恢复和非转移。
6。流式细胞仪和数据分析
- 流式细胞仪上运行的样品和分析数据。
7。代表性的成果
导致直方图的具体峰值降低抗原表位的特异性杀伤细胞（图1）的指标。使用下面的公式（在表1中的应用），以确定细胞特异性裂解的实际价值：
比率=不相关的百分比：抗原表位的特定百分比（[低]高峰：[高]峰），
具体裂解百分比= [1 - （非转移的比例控制/实验的比例）] × 100
图1。 CFSE配置文件恢复BALB / c小鼠脾的数字表明，高或低的CFSE表型的细胞的百分比。 A）非转移控制。 [高] CFSE峰代表抗原表位的特定的靶细胞，而[低] CFSE峰代表无关肽脉冲的目标。二）CFSE标记的细胞恢复PBS免疫收件人鼠标（控制）。三）CFSE标记的细胞恢复从两个不同的肽受体小鼠，注意减少特定的抗原表位峰。
图2。分析数据的图形表示。三个数据点显示各组小鼠，PBS肽A和肽B。
| 样品 | CFSE高％抗原表位脉冲 | CFSE低％不相关的 | 比低：高 | ％的表面抗原特异性杀伤 |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| 肽A | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| 肽A | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| 肽A | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| 肽乙 | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| 肽乙 | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| 肽乙 | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NT控制 | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| 佩普一个NT控制 | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| 佩普乙NT控制 | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
表1。有代表性的数据分析。“新台币”非转移。
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Discussion
此法可修改进行调查，包括克隆扩增细胞的增殖能力，因为CFSE划分较为平等的后代 10,11 。它也可以使用CFSE标签探讨细胞迁移6,12的，虽然也有其他细胞的跟踪方法，可能更合适，这取决于你的假设，例如四聚体和生物发光13，这也可能与CFSE标签相结合，。
它重要的是要注意入流式细胞仪上的多渠道，CFSE出血，所以如果你想表面标记染色，PeCy7将是一个不错的选择，荧光团，而PE可能不工作，以及。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。动物实验机构在美国威斯康星 - 麦迪逊大学的动物护理和使用委员会（IACUC）规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
我想感谢我介绍了免疫分析和鼠标处理比安卡Mothé，Oseroff卡拉和玛丽 - 法国DelGuercio。在GA的分配器实验室工作的经费由美国国立卫生研究院授予1 RO1 - AI - 073558，GLRCE授予1 - U54 - AI - 057153和Bard美3829 - 06。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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