Summary
Veel infecties roepen een sterke CTL-respons, maar af en toe, de hoeveelheid cellen die reageren niet correleren met de controle van de ziekteverwekker
Abstract
Carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFSE) kan worden gebruikt om eenvoudig en snel het etiket een cel populatie van belang zijn voor in vivo onderzoek. Deze etikettering is klassiek is gebruikt om de proliferatie en migratie te bestuderen. In de hier gepresenteerde methode, hebben we verkort de tijdlijn na adoptieve overdracht om te kijken naar overleving en doden van epitoop specifieke CFSE gelabelde doelcellen 4-6. Het niveau van specifieke doden van een CD8 + T-cel-kloon kan duiden op de kwaliteit van de reactie, aangezien hun hoeveelheid kan misleidend zijn. Specifieke CD8 + T-cellen kunnen functioneel uitgeput raken na verloop van tijd met een daling van de cytokine productie en het doden van 7,8. Ook kunnen bepaalde CD8 + T cel klonen niet zo goed als anderen te doden met verschillende TCR specifieke 9. Voor een effectieve cel gemedieerde immuniteit (CMI), moet antigenen worden geïdentificeerd die produceren niet alleen een voldoende aantal te reageren T-cellen, maar ook functioneel robuuste reageren T-cellen. Hier beoordelen we het percentage celspecifieke moord op twee peptide specifieke T-cel klonen in BALB / c muizen.
Protocol
1. Uitlokken van Target-specifieke CTL's Effector door immunisatie (Day 0)
- Voordat u begint, beslissen over een specifieke effector: target-systeem. In dit voorbeeld van een klassieke in-vivo-CTL-test, zullen we gebruik maken van een gezuiverd peptide immunisatie specifieke CD8 + T-cellen te lokken. Hetzelfde peptide zal worden gebruikt om de syngene doelcellen pols, het creëren van een specifieke effector: target-systeem. Als alternatief kunt u ervoor kiezen om hele pathogeen of eiwit te gebruiken om uw specifieke effectoren en doelstellingen te verkrijgen.
- Ontsmet het werkoppervlak binnenkant van een bioveiligheid kap om de steriliteit van de injecties te verzekeren. Bereid de peptide immunisatie door eerst 50 ug van gezuiverd peptide in 100 pi 10% DMSO in PBS / muis in een 2 ml buis. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid van zeer koud Incompleet Freund's adjuvans en tot aan de 0,2 ml markering met 1 mm kralen voor het mengen. Vanaf dit punt, blijf immunogeen op ijs tot injectie. Veilig deksel met Parafilm.
- Gebruik een kraal beater op maximum toerental aan de emulsie gedurende 3 minuten mengen, meteen het plaatsen van de emulsie weer op het ijs na het mengen. De resulterende emulsie dient van een vergelijkbare consistentie mayonaise. Laat emulsie te zitten bij 4 ° C gedurende de nacht als de tijd het toelaat (tot een week), mengen verder als een scheiding wordt opgemerkt.
- Gebruik een 1 ml spuit en 20 of 20,5 gauge naald te trekken emulsie en voorzichtig om niet trekken geen kralen (beads moet groter zijn dan gauge van de naald, maar nog steeds op de hoogte).
- Veilige muis voor subcutane injectie aan de basis van de staart. We maken gebruik van een aangepaste plastic 50 ml conische buis om veilig en voorzichtig immobiliseren de muis voor injectie. Injecteer de muis met 0,2 ml emulsie.
2. Oogsten doelcellen (Dag 8)
- U moet naïeve syngene muizen voor uw doelgroep cellen. Euthanaseren naïeve muizen volgens AAALAC normen.
- Desinfecteer de muis door het sproeien van 70% ethanol om de kans op besmetting van muis haar of andere externe verontreinigingen te minimaliseren.
- Met behulp van dissectie schaar maken kleine knip door de huid aan de linkerkant van de muis. Trek de huid flap naar peritoneale sac en interne organen bloot te leggen.
- Snip via het buikvlies, dat evenwel niet tot een van de onderliggende organen compromis. De milt is dicht bij het oppervlak en is vergelijkbaar in kleur naar de lever (donker rood), maar kleiner en nieren bonen in vorm. Geïnfecteerde muizen vertonen over het algemeen met name groter dan de milt niet-geïnfecteerde controle.
- Trek de milt, en zorg ervoor dat zacht, zodat er geen de milt te breken in meerdere stukken om een maximale cel aantallen te herstellen. Onmiddellijk plaats van de milt in een 15 ml conische met 10 ml van de bereide media op ijs. Ga verder met de resterende muizen.
- Giet de inhoud van de 15 mL conische buis (media en milt) in een glas weefsel slijpmachine. Maal de milt met behulp van tal van bovenarm kracht. Als alle weefsel heeft zijn kleur verloren kun je ervan uitgaan dat u alle cellen teruggewonnen uit van het bindweefsel.
- Giet de inhoud van de molen door een 70 um cel filter in een 50 ml conische buis. Spoel grinder met vers medium en giet door een zeef cel.
- Centrifugeer bij 4 ° C, 1300 RPM voor 7 minuten. Giet af supernatant.
- Resuspendeer in 10 ml van de bereide lyserend reagens en incubeer bij 37 ° C gedurende 7 minuten.
- Voeg tot 50 ml met verse media en centrifuge, hetzelfde als hierboven.
- Resuspendeer in 50 ml vers medium en de centrifuge, hetzelfde als hierboven (wasstap). * Opmerking: op dit moment kunt u een magnetische cel scheiding voor een bepaald celtype (dat wil zeggen macrofagen) uit te voeren als een pure doelcel bevolking is gewenst voor overdracht naar ontvangende muizen. Ook op dit moment kun je introduceren een experimentele behandeling in de cultuur om de effecten van die behandeling op het doden van cel-specifieke studie.
- Tellen cellen en plaat 1 x 10 7 per putje in 100μL in een 96 ronde bodem goed weefselkweek behandeld plaat. * Dit is een hoge concentratie van cellen / putje, maar omdat de test is een snelle een, we hebben gezien geen verlies van de levensvatbaarheid van de cellen bij deze concentratie.
3. Behandeling en etikettering van doelwitcellen
- Pulse juiste cellen en repliceert met de pathogeen specifieke peptide of irrelevant peptide controle: Voeg 1 ug / ml peptide. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1,5 uur. Ga naar 37 ° C incubator voor de laatste 30 minuten. Gedurende deze tijd voor te bereiden CFSE reagens.
- Bereid CFSE volgens de specificaties van de fabrikant en verdun het tot een werkende concentratie tussen 0,5 en 25 uM. Maak "laag" concentratie 10x lager dan "hoge" concentratie CFSE. Bijvoorbeeld, voor [laag] 0,5 pi CFSE toe te voegen aan 10 ml PBS en voor [high], 5 ui CFSE toe te voegen aan 10 ml PBS. Warm bereid CFSE tot 37 ° C voor de etikettering.
- Verwijder de plaat van cellen van de incubator en pellet in een hoge snelheid centrifuge bij kamertemperatuur, 1300 RPM voor 7 minuten. Flick te verwijderen supernatant.
- Resuspendeer cellen in een van beide [laag] of [HIGH] CFSE door het toevoegen van 200 pi van de juiste reagens om de bijbehorende putten en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder de plaat van cellen van de incubator en opnieuw pellet bij kamertemperatuur, 1300 RPM voor 7 minuten. Flick te verwijderen supernatant.
- Resuspendeer cellen in 200 ul / putje van opgewarmde verse media en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder de plaat van cellen van de incubator en pellet bij kamertemperatuur, 1300 RPM voor 7 minuten. Flick te verwijderen supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 ul / well PBS.
- Voor adoptieve overdracht, voeg een goed [laag] gelabelde cellen om een goed [high] gelabelde cellen per muis. Resulterende injectie moet worden 50% van specifieke doelen en 50% irrelevant cellen in 0,2 ml.
- Vergeet niet om vernietiging van een aantal gelabelde cellen als uw niet-overgedragen controles act tijdens de data-analyse en voor het rijden op de flowcytometer (zie figuur 1).
4. Adoptieve overdracht
- Verdoven eerder peptide geïmmuniseerde muizen (Van deel # 1 van dit protocol) volgens AAALAC normen.
- Injecteer 0,2 ml van gemerkte doelcellen via retro-orbitale route in de ontvangende muizen.
- Wacht 6 uur of een andere vooraf bepaalde optimale tijd voor euthanasie van de ontvanger muizen.
5. Oogsten gelabelde cellen
* Opmerking: De stappen 5.1 tot 5.11 zijn hetzelfde als de stappen 2.1 tot en met 2.11
- Tellen cellen en plaat uit op 1 x 10 6 per putje in 100 ul in 96 goed met ronde bodem weefselkweek behandeld plaat.
- Fix herstelde en de niet overgedragen cellen door toevoeging van 100 ul 2% paraformaldehyde tot een uiteindelijke concentratie van 1% paraformaldehyde aan alle putjes.
6. Flowcytometrie en data-analyse
- Lopen monsters op een flowcytometer en de gegevens analyseren.
7. Representatieve resultaten
Een afnemende epitoop specifiek piek op de resulterende histogram is een indicator van de cel specifieke doden (figuur 1). Gebruik de volgende vergelijkingen (toegepast in tabel 1) om de werkelijke waarde van de cel specifieke lysis te bepalen:
Ratio = Irrelevante Percentage: Epitoop bepaald percentage ([laag] peak: [hoog] piek),
Percentage Specifieke Lysis = [1 - (Non-controle overgebracht ratio / Experimentele ratio)] x 100
Figuur 1. CFSE profiel van herstelde BALB / c muis splenocyten. Getallen geven het percentage van cellen van de hoge of lage CFSE fenotype. A) Niet-overgedragen controle. Alle [high] CFSE pieken vertegenwoordigen epitoop specifieke doelgroepen cellen, terwijl [laag] CFSE pieken bevat streefdata gepulst met irrelevante peptide. B) CFSE gelabelde cellen hersteld van PBS geïmmuniseerde ontvanger muis (Control). C) CFSE gelabelde cellen hersteld van twee verschillende peptide specifieke ontvanger muizen, let op de verminderde epitoop specifieke pieken.
Figuur 2. Grafische weergave van de geanalyseerde gegevens. Drie datapunten getoond voor elke groep van muizen, PBS, Peptide A en B. Peptide
| Monster | CFSE HOOG% Epitoop Pulsed | CFSE LAAG% Irrelevant | Ratio Laag: Hoog | Procent Epitoop Specifieke Killing |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1.34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1.32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1.26 | 11,74 |
| Peptide A | 39,7 | 60,3 | 1.52 | 32,56 |
| Peptide A | 38,6 | 61,4 | 1.59 | 35,61 |
| Peptide A | 40,6 | 59,4 | 1.46 | 29,99 |
| Peptide B | 38,7 | 61,3 | 1.58 | 24,68 |
| Peptide B | 38,5 | 61,5 | 1.60 | 25,32 |
| Peptide B | 39,3 | 60,7 | 1.54 | 22,76 |
| PBS NT Controle | 47,4 | 52,6 1.11 | ||
| Pep Een NT controle | 49,4 | 50,6 | 1.02 | |
| Pep B NT Controle | 45,6 | 54,4 | 1.19 |
Tabel 1. Analyse van representatieve gegevens. "NT" is niet overgedragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze test kan worden aangepast aan de proliferatieve capaciteit van de cellen, met inbegrip klonale expansie te onderzoeken, omdat CFSE verdeelt relatief gelijkelijk over nageslacht 10,11. Het is ook mogelijk om CFSE labeling gebruiken om celmigratie 6,12 onderzoeken, maar er zijn ook andere cel tracing methoden die kunnen meer passend zijn, afhankelijk van uw hypothese, bijvoorbeeld tetrameren en bioluminescentie 13, die ook kan worden gecombineerd met CFSE labeling.
Het is belangrijk dat CFSE bloedingen nota over in meerdere kanalen op de flowcytometer, dus als je wilt co-vlek voor een oppervlakte-marker, zou PeCy7 een goede keuze van de fluorofoor, terwijl PE misschien niet zo goed werkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Wisconsin-Madison in te stellen.
Acknowledgments
Ik wil Bianca Mothe, Carla Oseroff, en Marie-France DelGuercio bedanken voor de invoering van mij om immunologische assays en muis hanteren. Werken in het lab van GA Splitter wordt gefinancierd door NIH subsidie 1-RO1-AI-073558, GLRCE subsidie 1-U54-AI-057153, en BARD VS-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
