Summary
זיהומים רבים לתגובה CTL חזק, אבל מדי פעם, כמות התאים להגיב אינו תואם לשליטה של הפתוגן
Abstract
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE) יכול לשמש בקלות ובמהירות תווית האוכלוסייה תא עניין של בחקירה vivo. תיוג זה קלאסי שימשו במחקר התפשטות והגירה. בשיטה המוצגת כאן, יש לנו לקצר את ציר הזמן לאחר העברת המאמצת להסתכל הישרדות הרג epitope ספציפי שכותרתו CFSE תאים היעד 4-6. רמת הרג ספציפי של שיבוט CD8 + T תא יכולה להעיד על איכות התגובה, כמו הכמות שלהם עלולה להטעות. ספציפיות CD8 + T תאים יכול להיות מותש מבחינה תפקודית לאורך זמן עם ירידה ייצור ציטוקינים והרג 7,8. כמו כן, בטוח CD8 + T שיבוטים תא לא יכול להרוג, כמו גם עם אחרים שונים ספציפיות TCR 9. לקבלת חסינות מתווכת יעיל תא (CMI), אנטיגנים חייב להיות מזוהה המייצרים לא רק מספרים נאותה להגיב בתאי T, אלא גם חזקים מבחינה פונקציונלית ותאי T להגיב. כאן אנו בוחנים את התא אחוז הרג ספציפי של שני פפטיד ספציפי שיבוטים תא T ב BALB / c עכברים.
Protocol
1. לעורר יעד ספציפיות ההרג מפעיל על ידי חיסון (יום 0)
- לפני שמתחילים, להחליט על מבצע ספציפי: מערכת היעד. בדוגמה זו של קלאסית assay CTL vivo, נשתמש חיסון פפטיד מטוהרים לעורר ספציפי CD8 + T לתאים. הפפטיד זהה ישמש הדופק התאים היעד syngeneic, יצירת מפעיל מסוים: מערכת היעד. לחלופין, אתה יכול לבחור להשתמש הפתוגן חלבון שלם או להשיג effectors הספציפי שלך ויעדים.
- לטהר את פני השטח של העבודה בתוך ברדס biosafety כדי להבטיח סטריליות של זריקות. הכן את חיסון הפפטיד הראשון על ידי הצבת 50 מיקרוגרם של הפפטיד מטוהרים לתוך DMSO 100 10% μL ב PBS / עכבר הכלול צינור 2 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף כמות זהה של adjuvant קר מאוד Incomplete של פרוינד ועד לציון 0.2 מ"ל עם חרוזים 1 מ"מ עבור ערבוב. מנקודה זו, לשמור immunogen על הקרח עד ההזרקה. מכסה מאובטח עם Parafilm.
- השתמש מקצף חרוז מוגדר RPMs המרבי לערבב את תחליב במשך 3 דקות, מיד הצבת אמולסיה חזרה על הקרח לאחר ערבוב. אמולסיה וכתוצאה מכך צריכה להיות דומה עקביות מיונז. אפשר לשבת ליד אמולסיה 4 ° C במשך הלילה אם היתרי זמן (עד שבוע), ערבוב נוסף, אם בכלל הפרדה הוא ציין.
- השתמש מזרק 1 מ"ל ו - 20 או 20.5 מחט מד להרים את תחליב נזהר שלא להרים את כל חרוזים (חרוזים צריך להיות גדול יותר מאשר מד של מחט, אבל עדיין להיות מודעים).
- עכבר Secure להזרקה תת עורית בבסיס הזנב. אנו משתמשים שונה צינור פלסטיק 50 מ"ל חרוטי בבטחה ובעדינות לשתק את העכבר להזרקה. הזרק את העכבר עם 0.2 מ"ל של תחליב.
2. יעד תאים קציר (יום 8)
- יהיה עליך עכברים syngeneic נאיבי עבור תאים היעד שלך. להרדים עכברים נאיבי על פי סטנדרטים AAALAC.
- לחטא את העכבר על ידי ריסוס אתנול 70% כדי לצמצם את הסיכוי לזיהום מהשיער העכבר או מזהמים חיצוניים אחרים.
- בעזרת מספריים לנתיחה לעשות חיתוך קטן דרך העור בצד שמאל של העכבר. משוך דש העור מעל לחשוף שק הצפק ואת האיברים הפנימיים.
- Snip דרך הצפק, נזהרים שלא כל פשרה של אברי הבסיס. הטחול הוא קרוב לפני השטח, והוא דומה בצבע אל הכבד (אדום כהה) אך קטן יותר שעועית כליות במצב. עכברים נגועים בדרך כלל להראות spleens בעיקר גדולים יותר שולטת נגוע.
- בזהירות להוציא את הטחול, מקפיד להיות עדין כדי לא לשבור את הטחול לחתיכות רבות על מנת לשחזר את המספרים תא מקסימלית. מיד למקום הטחול לתוך 15 מ"ל חרוטי המכיל 10 MLS התקשורת מוכן על הקרח. המשך עם עכברים הנותרים.
- יוצקים תוכן של צינור חרוטי 15 מ"ל (מדיה והטחול) לתוך מטחנת רקמת זכוכית. טוחנים את הטחול באמצעות שפע של כוח הזרוע. כאשר רקמה כל איבד את צבעו ניתן להניח כי יש לך התאושש כל התאים מתוך רקמת החיבור.
- יוצקים תוכן של מטחנת דרך מסנן 70 מיקרומטר התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. יש לשטוף את מטחנת עם התקשורת טריים ושופכים דרך מסננת התא.
- צנטריפוגה ב 4 ° C, 1300 סל"ד במשך 7 דקות. יוצקים את supernatant.
- Resuspend ב 10 MLS של מגיב lysing דגירה מוכן ב ° 37 במשך 7 דקות.
- הוסף עד 50 MLS עם התקשורת טריים צנטריפוגות, כנ"ל.
- Resuspend ב 50 מדיה MLS טריים צנטריפוגות, כנ"ל (שלב לשטוף). * הערה: בשלב זה ניתן לבצע הפרדה תא מגנטי עבור סוג תאים מסוים (מקרופאגים למשל), אם אוכלוסיה טהור תא היעד הרצוי להעברת לעכברים הנמען. כמו כן, בזמן הזה אתה יכול להציג טיפול ניסיוני לתוך התרבות על מנת לחקור את ההשפעות של טיפול מסוים על הרג התא.
- ספירת תאים ו צלחת 1 x 10 7 לכל היטב 100μL בצלחת 96 עגול גם רקמת תרבות תחתית טיפול. * זהו ריכוז גבוה של תאים / טוב, אלא בגלל assay הוא אחד מהיר, ראינו לא אובדן יכולת הקיום של תאים בריכוז הזה.
3. טיפול תיוג של תאים היעד
- תאים דופק המתאים משכפל עם פפטיד ספציפי פתוגן או שליטה פפטיד רלוונטי: הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל פפטיד. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות. העבר 37 ° C החממה במשך 30 דקות האחרונות. במהלך תקופה זו להכין ריאגנט CFSE.
- הכן CFSE על פי מפרט היצרן לדלל את ריכוז העבודה בין 0.5 לבין 25 מיקרומטר. הפוך את הריכוז "נמוך" 10x CFSE נמוך יותר "גבוה" ריכוז. לדוגמה, [נמוך] להוסיף 0.5 CFSE μL עד 10 MLS PBS עבור [גבוהים], מוסיפים 5 CFSE μL עד 10 MLS PBS. CFSE מוכן חם 37 ° C לפני תיוג.
- הסר את צלחת של תאים מן החממה pellet בצנטריפוגה במהירות גבוהה בטמפרטורת החדר, 1300 סל"ד במשך 7 דקות. פליק להסיר supernatant.
- תאים Resuspend באחת [נמוך] או CFSE [גבוה] על ידי הוספת 200 μL של מגיב המתאים בארות המתאים דגירה במשך 15 דקות על 37 ° C.
- הסר את צלחת של תאים מן החממה ושוב גלולה בטמפרטורת החדר, 1300 סל"ד במשך 7 דקות. פליק להסיר supernatant.
- תאים Resuspend ב 200 μL / גם של התקשורת טרי התחמם דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C.
- הסר את צלחת של תאים מן החממה גלולה בטמפרטורת החדר, 1300 סל"ד במשך 7 דקות. פליק להסיר supernatant.
- תאים Resuspend ב 100 μL / גם PBS.
- עבור העברת המאמצת, להוסיף גם [נמוך] תאים שכותרתו לטיפוס אחד מוכר היטב [גבוה] שכותרתו תאים לכל עכבר. כתוצאה הזרקה יש מטרות ספציפיות 50% תאים לא רלוונטי 50% 0.2-MLS.
- אל תשכח להפריש כמה תאים שכותרתו לשמש שולטת שאינם מועברים במהלך ניתוח נתונים עבור פועל על cytometer את הזרימה (ראו איור 1).
4. המאמצת העברת
- הרדימי הפפטיד לעכברים שחוסנו בעבר (מתוך חלק # 1 של פרוטוקול זה) על פי סטנדרטים AAALAC.
- הזרק 0.2 MLS של תאים היעד שכותרתו דרך המסלול רטרו מסלולית לעכברים הנמען.
- חכה 6 שעות או אחר זמן אופטימלי מראש לפני והרדמת חסד העכברים הנמען.
5. תאים תווית קציר
* הערה: שלבים 5.1 עד 5.11 זהים צעדים 2.1 דרך 2.11
- ספירת תאים ו צלחת החוצה 1 x 10 6 ל 100 μL היטב לתוך 96 תרבות עגול היטב לתחתית רקמות הצלחת הטיפול.
- תקן תאים התאושש ולא הועברו על ידי הוספת 100 paraformaldehyde 2% μL לריכוז סופי של paraformaldehyde 1% לכל הבארות.
6. תזרים cytometry וניתוח נתונים
- הפעל דגימות על cytometer זרימה ולנתח את הנתונים.
7. נציג תוצאות
שיא epitope צמצום מסוים על ההיסטוגרמה וכתוצאה מכך הוא אינדיקטור של הרג ספציפי תא (איור 1). השתמש המשוואות הבאות (מיושם טבלה 1) כדי לקבוע את הערך האמיתי של תמוגה תא ספציפי:
לא רלוונטי = יחס אחוז: אחוז מסוים epitope ([נמוך] שיא: [גבוה] שיא),
אחוז תמוגה ספציפיים = [1 - (Non-הועבר יחס מלאה / יחס ניסויית)] 100 x
באיור 1. פרופיל CFSE במדבר התאושש BALB / c splenocytes העכבר. מציינים את אחוז התאים של הפנוטיפ CFSE גבוה או נמוך. א) Non-העבירה את השליטה. כל [גבוה] CFSE פסגות מייצגים epitope תאים יעד ספציפי, בעוד [נמוך] פסגות CFSE לייצג מטרות פעמו עם פפטיד רלוונטי. ב) תאים CFSE שכותרתו התאושש עכבר הנמען PBS שחוסנו (Control). ג) תאים CFSE שכותרתו התאושש שני עכברים שונים פפטיד ספציפי הנמען, לציין את פסגות epitope פחתה ספציפיים.
איור 2. ייצוג גרפי של הנתונים נותחו. שלוש נקודות הנתונים המוצגים עבור כל קבוצה של עכברים, PBS, פפטיד A, ו B. פפטיד
| מדגם | Epitope HIGH CFSE% פעמו | CFSE% LOW לא רלוונטי | יחס נמוך: גבוה | Epitope אחוז ספציפיות הריגת |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| פפטיד | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| פפטיד | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| פפטיד | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| פפטיד B | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| פפטיד B | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| פפטיד B | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NT בקרה | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| פפ בקרה NT | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| פפ B NT בקרה | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
טבלה 1. ניתוח הנתונים נציג ". NT" הוא לא הועבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay זה יכול להיות שונה כדי לחקור את יכולת שגשוג של תאים, כולל הרחבת המשובטים, כי CFSE מתחלק יחסית שווה בשווה בין הצאצאים 10,11. אפשר גם להשתמש תיוג CFSE לחקור נדידת תאים 6,12, אם כי ישנם תאים אחרים התחקות השיטות עשוי להיות מתאים יותר בהתאם להשערה שלך, tetramers דוגמה פליטת אור 13, אשר גם עשוי להיות משולב עם תיוג CFSE.
חשוב לציין כי מדמם CFSE לתוך ערוצים מרובים על cytometer את הזרימה, כך שאם אתה רוצה לשתף כתם על סמן משטח, PeCy7 יהיה בחירה טובה של fluorophore, בעוד PE לא יכול לעבוד גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) מאוניברסיטת ויסקונסין במדיסון.
Acknowledgments
אני רוצה להודות ביאנקה Mothé, קרלה Oseroff, ומארי צרפת DelGuercio מציגה לי מבחני החיסוני וטיפול העכבר. העבודה במעבדה של ספליטר GA ממומנת על ידי מענק 1-NIH RO1-AI-073558, GLRCE מענק 1-U54-AI-057153, ובארד ארה"ב 3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
