Summary
कई संक्रमण एक मजबूत सीटीएल प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना है, लेकिन कभी कभी, जवाब कोशिकाओं की मात्रा रोगज़नक़ का नियंत्रण नहीं सहसंबंधी करता है
Abstract
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) आसानी से और जल्दी के लिए vivo जांच में ब्याज की एक सेल की आबादी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह लेबलिंग प्रतिष्ठित प्रसार और प्रवास का अध्ययन किया गया. यहाँ प्रस्तुत विधि में, हम गोद लेने के लिए और मिलान विशिष्ट CFSE लेबल लक्ष्य 4-6 कोशिकाओं के अस्तित्व और हत्या पर देखने के लिए स्थानांतरण के बाद इस समय छोटा है. CD8 + टी सेल क्लोन के विशिष्ट हत्या के स्तर प्रतिक्रिया की गुणवत्ता का संकेत, के रूप में उनकी मात्रा को गुमराह किया जा सकता है सकते हैं. विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं कार्यात्मक थक cytokine उत्पादन और 7,8 हत्या में गिरावट के साथ समय पर बन सकता है . इसके अलावा, कुछ CD8 + टी सेल क्लोनों के रूप में दूसरों के रूप में में अच्छी तरह से भिन्न TCR 9 specificities के साथ नहीं मार सकता. प्रभावी सेल मध्यस्थता प्रतिरक्षण (CMI) के लिए, प्रतिजनों की पहचान हो सकता है कि टी कोशिकाओं जवाब न केवल पर्याप्त संख्या में उत्पादन करना चाहिए, लेकिन यह भी कार्यात्मक मजबूत जवाब टी कोशिकाओं. यहाँ हम दो पेप्टाइड BALB / ग चूहों में विशेष टी सेल क्लोनों का प्रतिशत सेल विशिष्ट हत्या का आकलन करें.
Protocol
1. टीकाकरण लक्ष्य विशिष्ट effector CTLs eliciting (0 दिन)
- लक्ष्य सिस्टम: शुरू करने से पहले, एक विशिष्ट effector पर फैसला. Vivo सीटीएल परख में एक शास्त्रीय संगीत के इस उदाहरण में, हम एक शुद्ध पेप्टाइड प्रतिरक्षण का उपयोग करने के लिए विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं को प्रकाश में लाना होगा . लक्ष्य सिस्टम: एक ही पेप्टाइड syngeneic लक्ष्य कोशिकाओं नाड़ी, एक विशिष्ट effector बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. वैकल्पिक रूप से, आप पूरी रोगज़नक़ या प्रोटीन का उपयोग करने के लिए अपने विशिष्ट effectors और लक्ष्य प्राप्त करने के लिए चुन सकते हैं.
- इंजेक्शन के बाँझपन को सुनिश्चित करने के लिए एक जैव सुरक्षा हुड के काम की सतह के अंदर शुद्ध करना. पहली पीबीएस / माउस में 100 μL 10% DMSO के एक 2 एमएल ट्यूब में निहित में पेप्टाइड शुद्ध 50 μg रखकर पेप्टाइड प्रतिरक्षण तैयार. अगले, बहुत ठंड अपूर्ण Freund सहयोगी के एक बराबर राशि जोड़ने और मिश्रण के लिए 1 मिमी मोतियों के साथ 0.2 एमएल चिह्नित करने के लिए. इस बिंदु से, इंजेक्शन जब तक बर्फ पर immunogen रखना. Parafilm के साथ सुरक्षित ढक्कन.
- एक मनका RPMs को अधिकतम करने के लिए सेट करने के लिए 3 मिनट के लिए पायस मिश्रण, तुरंत वापस पायस मिश्रण के बाद बर्फ पर रखकर डिब्बा का उपयोग करें. परिणामस्वरूप पायस संगति में मेयोनेज़ के लिए समान होना चाहिए. पायस 4 में बैठने के लिए ° सी रातोंरात यदि समय परमिट, (करने के लिए एक सप्ताह) आगे मिश्रण है अगर किसी भी जुदाई उल्लेख किया है. दें
- 1 एमएल सिरिंज और 20 या 20.5 गेज सुई का प्रयोग करने के लिए किसी भी मोती खींच नहीं सावधान किया जा रहा पायस खींच (मोती सुई के गेज की तुलना में बड़ा होना चाहिए, लेकिन अभी भी बारे में पता होना).
- पूंछ के आधार पर उपचर्म इंजेक्शन के लिए सुरक्षित माउस. हम सुरक्षित करने के लिए एक संशोधित प्लास्टिक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें और धीरे से इंजेक्शन के लिए माउस स्थिर. पायस की 0.2 एमएल के साथ माउस इंजेक्षन.
2. फसल काटने वाले टारगेट कक्ष (दिवस 8)
- आप अपने लक्ष्य की कोशिकाओं के लिए भोले syngeneic चूहों की आवश्यकता होगी. AAALAC मानकों के अनुसार भोले चूहों euthanize.
- माउस बाल या अन्य बाह्य संदूषणों से प्रदूषण का मौका कम से कम 70% इथेनॉल छिड़काव द्वारा माउस कीटाणुरहित.
- विच्छेदन कैंची का उपयोग करना माउस के बाईं ओर पर त्वचा के माध्यम से छोटे कटाव करते हैं. त्वचा प्रालंब खींचो peritoneal थैली और आंतरिक अंगों को उजागर.
- Peritoneum के माध्यम से कटाव, सावधान किया जा रहा समझौते के लिए किसी भी अंतर्निहित अंगों के नहीं. तिल्ली सतह के करीब है और जिगर (गहरे लाल) रंग में समान है लेकिन छोटे और आकार में अधिक मूंग है. संक्रमित चूहों को आम तौर पर असंक्रमित नियंत्रण की तुलना में विशेष रूप से बड़ा spleens दिखाते हैं.
- ध्यान से बाहर तिल्ली खींच, ध्यान लेने के लिए कोमल इतनी के रूप में कई टुकड़ों में नहीं तिल्ली तोड़ने के लिए आदेश में अधिकतम सेल नंबर ठीक. तुरंत एक 15 एमएल तैयार मीडिया के 10 MLS युक्त शंक्वाकार में बर्फ पर तिल्ली जगह है. शेष चूहों के साथ जारी रखें.
- एक गिलास ऊतक चक्की में 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (मीडिया और तिल्ली) की सामग्री डालो. ऊपरी बांह की ताकत का बहुत का उपयोग तिल्ली पीस. जब सभी ऊतक अपना रंग खो दिया है तो आप मान सकते हैं कि आप संयोजी ऊतक से बाहर सभी कक्षों को बरामद किया है.
- एक 70 सुक्ष्ममापी सेल फिल्टर के माध्यम से एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में चक्की की सामग्री डालो. ताजा मीडिया के साथ चक्की कुल्ला और एक सेल झरनी के माध्यम से डाल देना.
- 4 में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस, 7 मिनट के लिए 1300 RPM को. सतह पर तैरनेवाला डालो.
- 10 7 मिनट के लिए 37 ° पर तैयार lysing और अभिकर्मक सेते MLS में Resuspend.
- 50 MLS ताजा मीडिया और अपकेंद्रित्र, इसके बाद के संस्करण के रूप में एक ही के साथ जोड़ें.
- 50 MLS ताजा मीडिया और अपकेंद्रित्र, ऊपर के रूप में एक ही (धोने कदम) में Resuspend. * नोट: इस समय आप एक विशेष सेल प्रकार के लिए एक चुंबकीय सेल जुदाई (यानी मैक्रोफेज) प्रदर्शन अगर एक शुद्ध लक्ष्य सेल की आबादी प्राप्तकर्ता चूहों में हस्तांतरण के लिए वांछित है. इसके अलावा, इस समय आप संस्कृति में एक प्रयोगात्मक उपचार शुरू क्रम में सेल विशिष्ट हत्या पर कि इलाज के प्रभावित करता है अध्ययन सकता है.
- 100μL में 96 अच्छी तरह से गोल नीचे टिशू कल्चर इलाज थाली में और अच्छी तरह से प्रति 10 x 7 1 थाली कोशिकाओं की गिनती. * यह अच्छी तरह / कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता है, लेकिन क्योंकि परख एक त्वरित एक है, हम इस एकाग्रता में कोशिकाओं की व्यवहार्यता में कोई नुकसान नहीं देखा है.
3. उपचार और लक्ष्य कोशिकाओं के लेबल
- पल्स उपयुक्त कोशिकाओं और रोगज़नक़ विशिष्ट पेप्टाइड या अप्रासंगिक पेप्टाइड नियंत्रण के साथ प्रतिकृति है: 1 / μg एमएल पेप्टाइड जोड़ें. 4 ° C पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं. पिछले 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएँ. इस समय के दौरान CFSE अभिकर्मक तैयार.
- निर्माता विनिर्देशों के अनुसार CFSE तैयार है और 0.5 और 25 सुक्ष्ममापी के बीच काम कर रहे एक एकाग्रता के लिए पतला. "कम" एकाग्रता "उच्च" एकाग्रता CFSE से कम 10x. उदाहरण के लिए, [कम] 10 MLS पीबीएस 0.5 μL CFSE जोड़ने के लिए और उच्च], 10 MLS पीबीएस 5 μL CFSE जोड़ने. गर्म 37 के लिए तैयार CFSE ° सी लेबलिंग से पहले.
- इनक्यूबेटर और पी से कोशिकाओं की थाली निकालेंकमरे के तापमान, 7 मिनट के लिए 1300 RPM को एक उच्च गति अपकेंद्रित्र में ellet. सतह पर तैरनेवाला हटायें झाड़.
- या तो [] कम या इसी कुओं के लिए उपयुक्त अभिकर्मक के 200 μL जोड़ने और 37 पर 15 मिनट के लिए सेते ° [] उच्च CFSE सी. में Resuspend कोशिकाओं
- कमरे के तापमान, 7 मिनट के लिए 1300 RPM को इनक्यूबेटर और फिर गोली से कोशिकाओं की थाली निकालें. सतह पर तैरनेवाला हटायें झाड़.
- 37 पर 200 में μL / अच्छी तरह से गरम ताजा मीडिया और 30 मिनट के लिए सेते Resuspend कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस
- इनक्यूबेटर और गोली से कमरे के तापमान, 7 मिनट के लिए 1300 RPM को कोशिकाओं की थाली निकालें. सतह पर तैरनेवाला हटायें झाड़.
- 100 μL / अच्छी तरह से पीबीएस में Resuspend कोशिकाओं.
- दत्तक हस्तांतरण के लिए, एक जोड़ अच्छी तरह [कम] एक करने के लिए लेबल कोशिकाओं अच्छी तरह [उच्च] लेबल माउस प्रति कोशिकाओं. इंजेक्शन परिणामस्वरूप 50% .2 MLS में विशिष्ट और लक्ष्य 50% अप्रासंगिक कोशिकाओं किया जाना चाहिए.
- के लिए अलग कुछ लेबल करने के लिए डेटा विश्लेषण के दौरान और प्रवाह cytometer पर चलाने के लिए अपने गैर हस्तांतरित नियंत्रण के रूप में कार्य कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) सेट करने के लिए मत भूलना.
4. दत्तक हस्तांतरण
- AAALAC मानकों के अनुसार पहले पेप्टाइड प्रतिरक्षित चूहों (इस प्रोटोकॉल के भाग # 1) anesthetize.
- प्राप्तकर्ता चूहों में रेट्रो कक्षीय मार्ग के माध्यम से लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के 0.2 MLS इंजेक्षन.
- 6 घंटे या अन्य पूर्व निर्धारित इष्टतम समय प्राप्तकर्ता चूहों euthanizing से पहले रुको.
5. फसल काटने वाले लेबल कक्ष
* नोट: चरण 5.1 5.11 के माध्यम से 2.11 चरणों के माध्यम से 2.1 के रूप में वही कर रहे हैं
- 1 x 10 6 प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं और बाहर प्लेट 96 अच्छी तरह से गोल नीचे टिशू कल्चर इलाज थाली में 100 μL में गणना.
- 1% के सभी कुओं paraformaldehyde की अंतिम एकाग्रता के लिए 100 μL 2% paraformaldehyde जोड़कर बरामद और गैर - हस्तांतरित कोशिकाओं को ठीक.
6. प्रवाह cytometry और डेटा विश्लेषण
- एक प्रवाह cytometer पर नमूने को चलाने के लिए और डेटा का विश्लेषण.
7. प्रतिनिधि परिणाम
जिसके परिणामस्वरूप हिस्टोग्राम पर एक ह्रासमान मिलान विशिष्ट चोटी सेल विशिष्ट हत्या (चित्रा 1) का एक संकेतक है. निम्न समीकरण (तालिका 1 में लागू) का उपयोग करने के लिए सेल विशिष्ट lysis के वास्तविक मूल्य का निर्धारण:
अनुपात = अप्रासंगिक प्रतिशत: मिलान विशिष्ट प्रतिशत ([कम] चोटी: [उच्च] पीक),
प्रतिशत विशिष्ट lysis = [1 (गैर हस्तांतरित नियंत्रण अनुपात / प्रायोगिक अनुपात)] x 100
चित्रा 1. BALB ग / माउस splenocytes बरामद संख्या का CFSE प्रोफ़ाइल उच्च या कम CFSE phenotype की कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है. ए) नियंत्रण गैर हस्तांतरित. सभी उच्च [] CFSE चोटियों मिलान विशिष्ट लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि [कम] CFSE चोटियों अप्रासंगिक पेप्टाइड के साथ स्पंदित लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं. बी) CFSE लेबल कोशिकाओं पीबीएस प्रतिरक्षित प्राप्तकर्ता माउस (नियंत्रण) से बरामद किया. सी) CFSE लेबल दो अलग पेप्टाइड विशिष्ट प्राप्तकर्ता चूहों से बरामद कोशिकाओं, कम मिलान विशिष्ट चोटियों ध्यान दें.
चित्रा 2. डेटा का विश्लेषण के ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व तीन डेटा बिंदुओं चूहों के प्रत्येक समूह, Pbs, पेप्टाइड, ए, और पेप्टाइड बी के लिए दिखाया
| नमूना | CFSE उच्च% मिलान स्पंदित | CFSE कम अप्रासंगिक% | उच्च: कम अनुपात | प्रतिशत मिलान विशिष्ट हत्या |
| पीबीएस | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| पीबीएस | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| पीबीएस | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| पेप्टाइड एक | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| पेप्टाइड एक | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| पेप्टाइड एक | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| पेप्टाइड बी | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| पेप्टाइड बी | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| पेप्टाइड बी | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| पीबीएस NT नियंत्रण | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| एक NT नियंत्रण पीईपी | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| पीईपी बी NT नियंत्रण | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
तालिका 1. प्रतिनिधि डेटा का विश्लेषण. "NT" गैर स्थानांतरित कर रहा है.
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Discussion
इस परख के लिए क्लोनल विस्तार सहित कोशिकाओं के proliferative क्षमता की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है है, क्योंकि CFSE 10,11 संतान के बीच अपेक्षाकृत समान रूप से विभाजित है. यह भी संभव है CFSE लेबलिंग का उपयोग करने के लिए सेल प्रवास 6,12 की जांच करने के लिए, यद्यपि वहाँ अन्य तरीकों कि अधिक उपयुक्त अपने परिकल्पना के आधार पर किया जा सकता है अनुरेखण उदाहरण tetramers और 13 bioluminescence, जो भी CFSE लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है है के लिए सेल.
प्रवाह cytometer पर कई चैनलों में अधिक है कि CFSE bleeds नोट है, तो यह महत्वपूर्ण है अगर आप एक सतह मार्कर के लिए सह दाग चाहते PeCy7 की fluorophore एक अच्छा विकल्प हो सकता है, जबकि पीई के रूप में अच्छी तरह से काम नहीं कर सकता.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की. जानवरों पर प्रयोग संस्थागत पशु देखभाल और Wisconsin-Madison विश्वविद्यालय में प्रयोग करें समिति (IACUC) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
मैं मुझे प्रतिरक्षाविज्ञानी assays और माउस से निपटने के लिए शुरू करने के लिए Bianca के MOTHE, कार्ला Oseroff, और Marie फ्रांस DelGuercio धन्यवाद देना चाहूंगा. GA अलगानेवाला की प्रयोगशाला में काम एनआईएच एक RO1 - ऐ - +०,७३,५५८ अनुदान, GLRCE 1-U54 - ऐ - 057,153 अनुदान, और अमेरिका ३८२९-06 चारण के द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
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