Summary
Molte infezioni provocano una forte risposta CTL, ma a volte, la quantità di cellule rispondono non è correlata al controllo del patogeno
Abstract
Carboxyfluorescein diacetato succinimidile estere (CFSE) può essere utilizzato per etichettare facilmente e rapidamente una popolazione di cellule per un esame più vivo. L'etichettatura è stata classicamente utilizzato per studiare la proliferazione e la migrazione. Nel metodo presentato qui, abbiamo accorciato la timeline dopo il trasferimento adottivo di guardare la sopravvivenza e l'uccisione di epitopo specifiche cellule bersaglio CFSE etichettato 4-6. Il livello di uccidere specifiche di una T CD8 + clone di cellule in grado di indicare la qualità della risposta, in quanto la loro quantità può essere fuorviante. Specifiche cellule T CD8 + può diventare funzionale esaurito nel tempo con un calo della produzione di citochine e uccidendo 7,8. Inoltre, alcuni cloni di cellule CD8 + T non può uccidere così come gli altri con diverse specificità TCR 9. Efficace per l'immunità cellulo-mediata (CMI), devono essere identificati antigeni che producono non solo un numero adeguato di risposta delle cellule T, ma anche funzionale, robusto cellule T risponde. Qui valutare l'uccisione delle cellule specifiche per cento dei due cloni T peptide specifico delle cellule in topi BALB / c.
Protocol
1. Suscitando CTL effettori target specifici di Immunizzazione (giorno 0)
- Prima di iniziare, decidere un effettore specifico: sistema di destinazione. In questo esempio di un classico test in vivo CTL, useremo una immunizzazione peptide purificato per suscitare specifiche cellule T CD8 +. Il peptide stesso sarà utilizzato per impulso delle cellule bersaglio singenici, creando un effettore specifico: sistema di destinazione. In alternativa, si può scegliere di utilizzare patogeno intero o proteine per ottenere il effettori e gli obiettivi specifici.
- Decontaminare il piano di lavoro all'interno di una cappa di biosicurezza per garantire la sterilità delle iniezioni. Preparare l'immunizzazione peptide di prima immissione 50 mg di peptide purificato in 100 microlitri di DMSO 10% in PBS / mouse contenuta in una provetta da 2 ml. Successivamente, aggiungere una quantità uguale di molto freddo adiuvante incompleto di Freund e fino alla tacca 0,2 ml con 1 perle mm per la miscelazione. Da questo punto, tenere immunogeno in ghiaccio fino ad iniezione. Coperchio sicuro con Parafilm.
- Utilizzare un battitore tallone impostato RPM massimo di mescolare l'emulsione per 3 minuti, prontamente ponendo l'emulsione di nuovo sul ghiaccio dopo la miscelazione. L'emulsione risultante dovrebbe essere simile nella consistenza alla maionese. Lasciare emulsione per sedersi a 4 ° C per una notte, se il tempo lo permette (fino ad una settimana), mescolando altri eventuali separazione è notato.
- Utilizzare una siringa da 1 ml e 20 o 20,5 gauge a tirare su emulsione facendo attenzione a non tirare a qualsiasi perline (perline dovrebbe essere maggiore di calibro di ago, ma ancora essere a conoscenza).
- Del mouse sicuro per iniezione sottocutanea alla base della coda. Usiamo un modificata plastica tubo da 50 ml conica in modo sicuro e delicatamente immobilizzare il mouse per l'iniezione. Iniettare il mouse con 0,2 ml di emulsione.
2. Cellule bersaglio raccolta (giorno 8)
- Avrete bisogno ingenuo singenici topi per le vostre cellule bersaglio. Euthanize topi ingenuo secondo gli standard AAALAC.
- Disinfettare il mouse a spruzzo 70% etanolo per ridurre al minimo il rischio di contaminazione da capelli mouse o altri contaminanti esterni.
- Dissezione con forbici fare snip piccoli attraverso la pelle sul lato sinistro del mouse. Tirare lembo cutaneo oltre a scoprire sacco peritoneale e gli organi interni.
- Snip attraverso il peritoneo, facendo attenzione a non compromettere uno degli organi sottostanti. La milza è vicino alla superficie ed è simile a colori per il fegato (rosso scuro), ma più piccoli e fagiolo più in forma. Topi infettati mostrano generalmente milza in particolare maggiore rispetto ai controlli non infetti.
- Estrarre delicatamente la milza, avendo cura di essere gentile per non rompere la milza in più parti al fine di recuperare il massimo numero di cellule. Collocare immediatamente la milza in un 15 ml conica contenente 10 ml di supporti preparati sul ghiaccio. Continuare con i topi rimanenti.
- Versare il contenuto della provetta 15 ml conica (media e milza) in un macinino fibra di vetro. Macinare la milza con un sacco di potenza superiore del braccio. Quando tutto il tessuto ha perso il suo colore che si può supporre che avete recuperato tutte le cellule dal tessuto connettivo.
- Versare il contenuto della smerigliatrice attraverso un filtro a 70 micron di cellule in una provetta da 50 ml. Sciacquare smerigliatrice con mezzi freschi e versare attraverso un colino cellula.
- Centrifugare a 4 ° C, a 1300 RPM per 7 minuti. Eliminare il surnatante.
- Risospendere in 10 ml di reagente di lisi preparata e incubare a 37 ° per 7 minuti.
- Aggiungere fino a 50 ml con mezzi freschi e centrifuga, come sopra.
- Risospendere in 50 ml mezzi freschi e centrifuga, come prima (fase di lavaggio). * Nota: In questo momento è possibile eseguire una separazione magnetica cella per un tipo specifico di cellule (macrofagi esempio) se una pura popolazione di cellule bersaglio è desiderato per il trasferimento in topi riceventi. Inoltre, in questo momento si potrebbe introdurre un trattamento sperimentale nella cultura al fine di studiare gli effetti di tale trattamento sulla morte delle cellule specifiche.
- Contare le celle e la piastra di 1 x 10 7 per bene in 100μL in 96 pozzetti rotonda coltura tissutale piastra inferiore trattati. * Si tratta di un'alta concentrazione di cellule / pozzetto, ma perché il saggio è una veloce, abbiamo visto alcuna perdita di vitalità delle cellule a questa concentrazione.
3. Trattamento e etichettatura delle cellule bersaglio
- Cellule impulsi appropriati e replica con peptide specifico agente patogeno o di controllo peptide irrilevante: Aggiungere 1 mg / ml peptide. Incubare a 4 ° C per 1,5 ore. Passare a 37 ° C incubatore negli ultimi 30 minuti. Durante questo tempo preparare il reagente CFSE.
- Preparare CFSE secondo le specifiche del produttore e diluire ad una concentrazione di lavoro tra 0,5 e 25 micron. Fai la concentrazione "basso" 10 volte inferiore a quello CFSE "alta" concentrazione. Ad esempio, per [basso] CFSE aggiungere 0,5 microlitri a 10 ml PBS e per [alto], aggiungere 5 CFSE microlitri a 10 ml PBS. Caldo CFSE preparati a 37 ° C prima di etichettatura.
- Rimuovere la piastra di cellule da incubatore e pEllet in una centrifuga ad alta velocità a temperatura ambiente, 1300 RPM per 7 minuti. Flick per rimuovere supernatante.
- Risospendere le cellule in entrambi [basso] o [alto] CFSE con l'aggiunta di 200 ml di reagente appropriato ai pozzetti corrispondenti e incubare per 15 minuti a 37 ° C.
- Rimuovere la piastra di cellule da incubatore e di nuovo pellet a temperatura ambiente, 1300 RPM per 7 minuti. Flick per rimuovere supernatante.
- Risospendere le cellule in 200 l / pozzetto di scaldato mezzi freschi e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
- Rimuovere la piastra di cellule da incubatore e pellet a temperatura ambiente, 1300 RPM per 7 minuti. Flick per rimuovere supernatante.
- Risospendere le cellule in 100 l / pozzetto PBS.
- Per il trasferimento adottivo, aggiungere un bene [basso] cellule marcate ad un pozzetto [alto] etichettati cellule per topo. Conseguente iniezione deve essere del 50% obiettivi specifici e il 50% di cellule irrilevante in 0,2 ml.
- Non dimenticare di mettere da parte alcune cellule etichettati in modo da agire come i controlli non trasferiti durante l'analisi dei dati e per l'esecuzione del citofluorimetro (vedi figura 1).
4. Trasferimento adottivo
- Anestetizzare topi immunizzati precedentemente peptide (Da parte # 1 di questo protocollo) secondo gli standard AAALAC.
- Iniettare 0,2 ml di cellule bersaglio marcato via retro-orbitale percorso in topi riceventi.
- Attendere 6 ore o altro tempo predeterminato ottimale prima di eutanasia i topi destinatario.
5. La raccolta cellule marcate
* Nota: I punti 5.1 e 5,11 sono gli stessi passi da 2.1 a 2,11
- Contare le celle e la piastra presso 1 x 10 6 per bene in 100 ul in 96 cultura fondo piatto e tondo tessuti trattati.
- Fissare le cellule recuperate e non trasferiti aggiungendo 100 microlitri paraformaldeide al 2% ad una concentrazione finale di 1% paraformaldeide a tutti i pozzetti.
6. Citometria a flusso e analisi dei dati
- Esegui campioni su un citofluorimetro e analizzare i dati.
7. Rappresentante Risultati
Un picco epitopo diminuendo specifiche sul istogramma risultante è un indicatore di uccidere cellule specifiche (Figura 1). Usare le seguenti equazioni (applicato nella tabella 1) per determinare il valore reale di lisi delle cellule specifiche:
= Rapporto Irrilevante Percentuale: percentuale epitopi specifici (di picco [basso]: [alto] di picco),
Percentuale Lysis specifica = [1 - (no trasferiti rapporto di controllo / rapporto Sperimentale)] x 100
Figura 1. CFSE profilo dei numeri recuperato BALB / c splenociti mouse. Indicare la percentuale di cellule del fenotipo CFSE alto o basso. A) non ha trasferito il controllo. Tutti [alto] CFSE picchi rappresentano epitopo cellule bersaglio specifico, mentre [basso] picchi CFSE costituiscono un obiettivo di impulsi con peptide irrilevante. B) le cellule CFSE etichettati recuperato dal destinatario del mouse immunizzati PBS (controllo). C) le cellule CFSE etichettati recuperato da due differenti topi riceventi peptide specifico, notare i picchi epitopo diminuita specifici.
Figura 2. Rappresentazione grafica dei dati analizzati. Tre punti dati mostrati per ogni gruppo di topi, PBS, peptide A e B. Peptide
| Campione | Epitopo% CFSE pulsata ad alta | CFSE% BASSO Irrilevante | Rapporto di Basso: Alta | Uccidere per cento epitopi specifici |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1,34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1,32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1,26 | 11,74 |
| Un peptide | 39,7 | 60,3 | 1,52 | 32,56 |
| Un peptide | 38,6 | 61,4 | 1,59 | 35,61 |
| Un peptide | 40,6 | 59,4 | 1,46 | 29,99 |
| Peptide B | 38,7 | 61,3 | 1,58 | 24,68 |
| Peptide B | 38,5 | 61,5 | 1,60 | 25,32 |
| Peptide B | 39,3 | 60,7 | 1,54 | 22,76 |
| PBS NT controllo | 47,4 | 52,6 1,11 | ||
| Pep Un Controllo NT | 49,4 | 50,6 | 1,02 | |
| Pep B NT controllo | 45,6 | 54,4 | 1,19 |
Tabella 1. Analisi dei dati rappresentativi. "NT" non è trasferito.
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Discussion
Questo test può essere modificato per indagare la capacità proliferativa delle cellule, tra cui l'espansione clonale, perché CFSE divide equamente tra progenie relativamente 10,11. E 'anche possibile utilizzare l'etichettatura CFSE per studiare la migrazione delle cellule 6,12, anche se ci sono altre cellule tracciamento metodi che possono essere più appropriato a seconda delle ipotesi, per esempio tetrameri e bioluminescenza 13, che può anche essere combinato con l'etichettatura CFSE.
E 'importante notare che sanguina CFSE oltre in più canali sul citometro a flusso, quindi se si vuole co-macchia per un marker di superficie, PeCy7 sarebbe una buona scelta di fluoroforo, mentre il PE potrebbe non funzionare altrettanto bene.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) presso l'Università del Wisconsin-Madison.
Acknowledgments
Vorrei ringraziare Bianca Mothe, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio per avermi fatto conoscere saggi immunologici e gestione del mouse. Il lavoro nel laboratorio di GA Splitter è finanziato dal NIH concedere 1-RO1-AI-073558, GLRCE concedere 1-U54-AI-057153, e BARD USA-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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