Summary
多くの感染症は、強力なCTL応答を誘発するが、時折、応答する細胞の量は、病原体の制御に相関しない
Abstract
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）を容易かつ迅速に生体内での調査のための関心の細胞集団を標識するために使用することができます。この標識は、古典的な増殖と移動を研究するために使用されています。ここで紹介した方法では、我々は、エピトープの特定のCFSE標識した標的細胞を4-6の生存と殺害を見に養子移入した後にタイムラインを短縮している。その量は、誤解を招く可能性があるとしてCD8 + T細胞クローンの特定の殺害のレベルは、応答の質を示すことができます。特定のCD8 + T細胞はサイトカイン産生と7,8を殺すの低下と時間をかけて機能的に枯渇することができます。また、特定のCD8 + T細胞クローンは、異なるTCRの特異性9と同様に他人を殺すしないことがあります。効果的な細胞性免疫（CMI）の場合、抗原はT細胞の応答の適切な数字だけでなく、機能的に堅牢な応答性T細胞だけを作り出すことを識別する必要があります。ここでは、BALB / cマウスに2つのペプチド特異的T細胞クローンのパーセントの細胞特異的殺傷を評価する。
Protocol
1。予防接種によってターゲット固有のエフェクターCTLを誘発する（0日）
- ターゲットシステム：開始する前に、特定のエフェクターを決定するとき。 in vivoで CTLアッセイにおける古典のこの例では、我々は特異的CD8 + T細胞を誘発するために精製されたペプチドの予防接種を使用します。ターゲットシステム：同ペプチドは特定のエフェクターを作成し、同系の標的細胞をパルスするために使用されます。また、あなたの特定のエフェクタと目標を得るために全体の病原体やタンパク質を使用することもできます。
- 注射の無菌性を確保するためにバイオセーフティフードの作業面の内側を除染。最初の2 mL試験管に含まれているPBS /マウスに100μLの10％DMSOにペプチドを精製した50μgのを配置することにより、ペプチド免疫を準備します。次に、混合するための1ミリメートルビーズで、最大0.2 mLのマークに非常に冷たい不完全フロイントアジュバントを等量を追加し、。この点から、注入するまで氷上に免疫を保つ。パラフィルムでふたを固定します。
- 速やかに混合後、氷上に戻って乳剤を配置、3分間エマルジョンを混合するために最大のRPMに設定ビーズビーターを使用してください。得られたエマルジョンは、一貫性のマヨネーズのようになります。エマルジョンは、任意の分離が明記されている場合、さらにミキシング、（最大週まで）時間が許せば℃で一晩4℃で座ってすることができます。
- どんなビーズをプルアップしないように注意して乳剤をプルアップするために1 mLの注射器と20または20.5ゲージの針を使用してください（ビーズは針のゲージよりも大きくなるが、それでも知っておく必要があります）。
- 尾の基部に皮下注射のための安全なマウス。我々は安全に優しく注射のためにマウスを固定化するように変更プラスチック50 mLコニカルチューブを使用してください。エマルジョンの0.2 mLでマウスを注入する。
2。収穫標的細胞（8日目）
- あなたの標的細胞に対してナイーブ同系マウスが必要になります。 AAALACの基準にしたがってナイーブマウスを安楽死させる。
- マウスの毛や他の外部の汚染物質からの汚染の可能性を最小限に抑えるために70％エタノールを噴霧することにより、マウスを消毒する。
- 解剖鋏を使用すると、マウスの左側に皮膚を通して小さなスニップを行います。腹膜嚢と内臓を明らかに皮膚のフラップを上に引き出します。
- 腹膜を介して切り取り、基盤となる臓器のいずれかを妥協しないように注意している。脾臓は、表面に近く、色の肝臓（暗赤色）に似ていますが、小さいと形でより多くの腎臓のBeanです。感染マウスは、一般的に感染していないコントロールよりも顕著に大きい脾臓を示しています。
- 慎重になるよう最大の細胞数を回復するために複数の断片に脾臓を壊さないように穏やかなものに注意しながら、脾臓を引き出します。すぐに氷上に準備したメディアの10 MLSを含む15 mLコニカルに脾臓を置きます。残りのマウスに進みます。
- ガラスの組織グラインダーに15 mLコニカルチューブ（メディアおよび脾臓）の内容を注ぐ。アッパーアームの強度を十分に使用して脾臓を挽く。すべての組織がその色を失ったときは、結合組織の外のすべてのセルを回復していると仮定してよい。
- 50 mLコニカルチューブに70μmのセルのフィルターを通してグラインダーの内容を注ぐ。新鮮な培地でグラインダーをすすぎ、セルストレーナーを通して注ぎます。
- 4℃遠心° C、7分1300 RPM。上清を捨て。
- 7分37℃で調製した溶解試薬とインキュベート10 MLSに再懸濁します。
- 上記と同じ、新鮮な培地と遠心で50 MLSまで追加。
- （洗浄ステップ）上記と同じ、50mlの新鮮な培地と遠心分離機で懸濁します。 *注：純粋な標的細胞の集団が、レシピエントマウスへの伝達のために望まれている場合は、この時点で、特定の細胞型（すなわちマクロファージ）のための磁気細胞分離を行うことができます。また、この時点では、セル固有の殺害にその治療の影響を研究するために、文化に実験的治療を導入することもできます。
- プレート治療を96ウェル丸底の組織培養で100μLに1ウェルあたりの細胞とプレート1 × 10 7を数える。 *これは、細胞/ウェルの高濃度ですが、アッセイは迅速なものであるため、我々はこの濃度で細胞の生存率には損失を見たことがありません。
3。標的細胞の治療とラベリング
- パルス適切な細胞と病原体の特定のペプチドまたは無関係なペプチドの制御と複製すると、1μg/ mlのペプチドを追加。 1.5時間4℃でインキュベートする。最後の30分間37℃のインキュベーターに移動します。この時間の間にCFSEの試薬を準備する。
- 製造業者の仕様に従ってCFSEを準備し、0.5〜25μMの間に仕事上の濃度に希釈する。 "高"濃度CFSEよりも低い"低"濃度が10倍にします。たとえば、[低]に10 MLS PBSに0.5μLCFSEを追加し、[高]のために、10mlのPBSに5μLCFSEを追加。 37〜暖かい準備CFSE ° Cラベリングの前に。
- インキュベーターとpからの細胞のプレートを取り外します室温での高速遠心分離機、7分1300 RPMでエレト。上清を除去するフリック。
- 37℃で15分間対応するウェルでインキュベートするための適切な試薬200μLを加えることによってどちらかの[低]または[高] CFSE℃で再懸濁し、細胞
- 7分間、室温、1300 RPMのインキュベーターと再びペレットからの細胞のプレートを取り外します。上清を除去するフリック。
- 37℃で30分間、200μL/ウェル暖め新鮮な培地とインキュベートで再懸濁し、細胞を℃に
- 7分間、室温、1300 RPMでのインキュベーターとペレットからの細胞のプレートを取り外します。上清を除去するフリック。
- 100μL/ウェルのPBSに再懸濁し、細胞。
- 養子移入のために、うまくつのマウスごとにも[高]標識された細胞への[低]というラベルの付いたセルを追加します。注入の結果は、0.2 MLSの50％具体的な目標と50％無関係のセルでなければなりません。
- （図1を参照）データの解析中に、フローサイトメーターで実行されているため、非転送コントロールとして動作するいくつかの標識された細胞を取っておくことを忘れないでください。
4。養子免疫伝達
- 以前にペプチド免疫したマウスを麻酔（このプロトコールの一部＃1から）AAALACの基準によると。
- レシピエントマウスに眼窩経路を介して標識した標的細胞の0.2 MLSを注入する。
- レシピエントマウスを安楽死する前に6時間または他の所定の最適な時間を待つ。
5。収穫標識細胞
*注：5.11を介してステップ5.1ステップ2.11を介して2.1と同じである
- 96ウェル丸底の組織培養処理されたプレートに100μLの1 × 1ウェルあたり10 6で細胞とプレートを数える。
- すべてのウェルに1％パラホルムアルデヒドの最終濃度に100μLの2％のパラホルムアルデヒドを添加することにより回収し、非導入細胞を修正。
6。フローサイトメトリーおよびデータ解析
- フローサイトメーターでサンプルを実行し、データを分析する。
7。代表的な結果
結果として得られるヒストグラム上で逓減エピトープの特定のピークは、細胞特異的殺（図1）の指標です。細胞特異的溶解の実際の値を決定するには、次の式を（表1に適用される）を使用します。
比=関連性のない割合：エピトープ特異的割合（[低]ピーク：[高]ピーク）、
パーセント特異的溶解= [1 - （非転送制御率/実験比）] × 100
図1。 BALB / cマウスの脾細胞を回収した。番号のCFSEのプロファイルは、ハイまたはローCFSEの表現型の細胞の割合を示している。 A）コントロールを非譲渡。 [低] CFSEのピークは無関係のペプチドをパルスしたターゲットを表す一方、すべての[高] CFSEのピークは、エピトープの特定の標的細胞を表しています。 B）CFSE標識された細胞は、PBS免疫レシピエントマウス（コントロール）から回収。 C）二つの異なるペプチドの特定のレシピエントマウスから回収したCFSE標識された細胞は、減少したエピトープの特定のピークに注意してください。
図2。分析したデータのグラフィカル表現。3つのデータ点は、マウスの各グループ、PBS、ペプチドA、およびペプチドBで示すように
| サンプル | CFSE HIGH％のエピトープは、パルス | 無関係なCFSE LOW％ | 高：低比 | パーセントのエピトープ特異的殺害 |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| ペプチド | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| ペプチド | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| ペプチド | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| ペプチドB | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| ペプチドB | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| ペプチドB | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NTのコントロール | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| ペップNTのコントロール | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| ペップB NTのコントロール | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
表1。代表的なデータの分析。"NT"は、非転送です。
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Discussion
CFSEは子孫10,11の間で比較的均等に分割するので、このアッセイは、クローン性増殖を含む細胞の増殖能を調査するように変更することができます。また、CFSE標識と組み合わせることができる例の四量体および生物発光13あなたの仮説に応じてより適切な方法をトレースし、他のセルが、、ありますがそれは、細胞遊走6,12を調査するためにラベル付けCFSEを使用することも可能です。
PEも同様に動作しない可能性があります中には、表面マーカーのために共同で染色する場合、それはそう、フローサイトメーター上で複数のチャネルに介してそのCFSEの出血に注意することが重要である、PeCy7は、蛍光団のを選ぶとよいでしょう。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。動物実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の動物実験使用委員会（IACUC）によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
Acknowledgments
私は免疫学的アッセイやマウス操作に私を導入するためビアンカMOTHE、カルラOseroff、とマリー=フランスDelGuercioに感謝したいと思います。 GAスプリッタのラボでの作業は、NIHの助成金1 - RO1 - AI - 073558、GLRCE助成1 - U54 - AI - 057153、およびBARD US - 3829から06によって運営されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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