Summary
Muitas infecções provocar uma forte resposta CTL, mas, ocasionalmente, a quantidade de células que respondem não se relaciona com o controle do patógeno
Abstract
Diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) pode ser usado para facilmente e rapidamente rótulo uma população de células de interesse para a investigação in vivo. Esta rotulagem tem sido classicamente utilizado para o estudo da proliferação e migração. No método aqui apresentado, temos reduzido o cronograma, após a transferência adotiva de olhar para a sobrevivência e morte de epítopo específico CFSE células-alvo marcado 4-6. O nível de matar específica de um clone de células T CD8 + pode indicar a qualidade da resposta, como a sua quantidade pode ser enganosa. Específicos células T CD8 + podem se tornar funcionalmente esgotado ao longo do tempo com um declínio na produção de citocinas e matando 7,8. Além disso, certos CD8 + clones de células T não pode matar, bem como outros com diferentes especificidades TCR 9. Eficazes para Imunidade mediada por células (CMI), os antígenos devem ser identificados que produzem não apenas um número adequado de células T responder, mas também funcionalmente robusta células T responder. Aqui nós avaliamos a morte de células específicas de dois por cento peptídeo clones específicos de células T em camundongos BALB / c.
Protocol
1. Provocando destino-específico CTLs efetoras de Imunização (Dia 0)
- Antes de começar, decida em cima de um efetor específicos: sistema de destino. Neste exemplo de um clássico ensaio in vivo de CTL, usaremos uma imunização peptídeo purificado para provocar específicas CD8 + T células. O peptídeo mesma será usada para pulso as células-alvo singênico, criando um efetor específicos: sistema de destino. Alternativamente, você pode optar por utilizar patógeno todo ou proteínas para obter o seu efetores e metas específicas.
- Descontaminar a superfície de trabalho dentro de uma capa de biossegurança para garantir a esterilidade das injeções. Prepare a imunização peptídeo primeira colocação por 50 mg de peptídeo purificado em 100 mL DMSO 10% em PBS / mouse contidos em um tubo de 2 mL. Em seguida, adicione uma quantidade igual de muito frio adjuvante de Freund incompleto e até a marca de 0,2 mL com 1 mm para contas de mistura. A partir deste ponto, mantenha imunógeno em gelo até injeção. Tampa segura com Parafilm.
- Use um batedor de talão definido para RPMs máximo para misturar a emulsão por 3 minutos, colocando imediatamente a emulsão de volta no gelo após a mistura. A emulsão resultante deve ser semelhante em consistência à maionese. Permitir emulsão para sentar-se a 4 ° C durante a noite se o tempo permitir (até uma semana), a mistura de outros eventuais separação é anotado.
- Use uma seringa de 1 mL e 20 ou 20,5 agulha para puxar para cima emulsão tendo o cuidado de não puxar para cima todas as pérolas (contas deve ser maior que calibre de agulha, mas ainda estar ciente).
- Rato seguro para injeção subcutânea na base da cauda. Nós usamos uma versão modificada plásticos de 50 mL do tubo cônico de forma segura e suavemente imobilizar o mouse para injeção. Injetar o mouse com 0,2 mL de emulsão.
2. Colheita células-alvo (dia 8)
- Você vai precisar de ingênuo camundongos isogênicos para as células-alvo. Euthanize camundongos ingênuos de acordo com padrões AAALAC.
- Desinfectar rato por pulverização Etanol 70% para minimizar a possibilidade de contaminação do cabelo do mouse ou de outros contaminantes externos.
- Com uma tesoura de dissecção fazer snip pequenos através da pele no lado esquerdo do mouse. Puxe retalho de pele mais para descobrir saco peritoneal e órgãos internos.
- Snip através do peritônio, tomando cuidado para não comprometer os órgãos subjacentes. O baço é próximo à superfície e é similar na cor para o fígado (vermelho escuro), mas menor e mais feijão rim em forma. Camundongos infectados geralmente apresentam baços notadamente maiores do que os controles não infectados.
- Retire cuidadosamente o baço, tendo o cuidado de ser gentil para não quebrar o baço em várias partes, a fim de recuperar o número de células máxima. Colocar imediatamente o baço em um 15 mL cônico contendo 10 mL de meios preparados no gelo. Continue com ratos restantes.
- Despeje o conteúdo do tubo de 15 mL cônica (media e do baço) em um moedor de tecido de vidro. Moer o baço usando muita força no braço. Quando todo o tecido perdeu a sua cor que você pode supor que você tenha recuperado todas as células fora do tecido conjuntivo.
- Despeje o conteúdo do moinho através de um filtro de células 70 M em um tubo cônico de 50 mL. Enxágüe moedor com a mídia fresco e despeje através de um filtro de células.
- Centrífuga a 4 ° C, 1300 RPM por 7 minutos. Deitar fora o sobrenadante.
- Ressuspender em 10 ml de reagente de lise preparada e incubar a 37 º durante 7 minutos.
- Adicionar até 50 ml com a mídia fresco e centrífuga, mesmo que o anterior.
- Ressuspender em 50 ml de mídia fresco e centrífuga, mesmo que o anterior (etapa de lavagem). * Nota: Neste momento é possível realizar uma separação de células magnéticas para um tipo específico de célula (macrófagos, por exemplo), se uma população de células-alvo puro é desejado para a transferência em camundongos destinatário. Além disso, neste momento você poderá introduzir um tratamento experimental para a cultura, a fim de estudar os efeitos do que o tratamento em matar células específicas.
- Contagem de células e placa de 1 x 10 7 por bem em 100μL em uma placa de 96 cultura de tecidos bem fundo redondo tratada. * Esta é uma alta concentração de células / poço, mas porque o ensaio é um rápido, temos visto nenhuma perda da viabilidade das células nesta concentração.
3. Tratamento e marcação das células-alvo
- Células de pulso apropriada e repetições, com peptídeo de patógenos específicos ou controle peptídeo irrelevante: Adicionar um peptídeo mcg / mL. Incubar a 4 ° C por 1,5 horas. Mover-se para 37 ° C incubadora nos últimos 30 minutos. Durante este tempo, preparar o reagente CFSE.
- Prepare CFSE de acordo com as especificações do fabricante e diluir para uma concentração de trabalho entre 0,5 e 25 mM. Faça concentração "baixa" de 10x menor que CFSE concentração "alto". Por exemplo, para [baixo] adicionar 0,5 mL CFSE a 10 mls PBS e para [alta], adicionar 5 mL CFSE a 10 mls PBS. CFSE preparado quente a 37 ° C antes de rotulagem.
- Retire a placa de células de incubadora e pEllet em uma centrífuga de alta velocidade à temperatura ambiente, 1300 RPM por 7 minutos. Flick para remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células em qualquer [baixo] ou CFSE [alta], adicionando 200 mL de reagente adequado para os poços correspondentes e incubar por 15 minutos a 37 ° C.
- Retire a placa de células de incubadora e de novo pellet em temperatura ambiente, 1300 RPM por 7 minutos. Flick para remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 200 mL / poço de mídia fresco aquecido e incubar por 30 minutos a 37 ° C.
- Retire a placa de células de incubadora e pellet em temperatura ambiente, 1300 RPM por 7 minutos. Flick para remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 mL / poço de PBS.
- Para a transferência adotiva, adicione um bem [baixo] células marcadas para um bem [de alta] rotulados células por mouse. Resultantes da injecção deve ser de 50% metas específicas e 50% de células irrelevante em 0,2 mls.
- Não se esqueça de reservar algum células marcadas para atuar como seus controles não-transferidos durante a análise de dados e para executar no citômetro de fluxo (Figura 1).
4. Transferência adotiva
- Anestesiar previamente peptídeo camundongos imunizados (De parte # 1 do presente protocolo) de acordo com padrões AAALAC.
- Injetar 0,2 mL de células-alvo marcado via retro-orbital rota em camundongos destinatário.
- Esperar 6 horas ou tempo predeterminado outras ideal antes de eutanásia os ratos destinatário.
5. Colheita células marcadas
* Nota: Os passos 5.1 a 5,11 são os mesmos passos 2.1 a 2,11
- Contagem de células e placa para fora em 1 x 10 6 por poço em 100 mL em 96 cultura bem fundo redondo de tecido placa tratada.
- Fix células recuperado e não transferidos pela adição de 100 mL de paraformaldeído 2% para uma concentração final de paraformaldeído 1% em todos os poços.
6. Citometria de Fluxo e Análise de Dados
- Executar amostras em um citômetro de fluxo e analisar os dados.
7. Resultados representante
Um pico diminuindo epítopo específico no histograma resultante é um indicador de matar células específicas (Figura 1). Use as seguintes equações (aplicado na Tabela 1) para determinar o valor real de lise específica de células:
Percentual = relação Irrelevante: Percentagem específicas Epitope (pico [baixo]: [alta] pico),
Lise por cento específico = [1 - (Non-transferidos relação controle / relação Experimental)] x 100
Figura 1. CFSE perfil de Números recuperados esplenócitos BALB / c mouse. Indicam a porcentagem de células do fenótipo CFSE alta ou baixa. A) não transferiu o controle. Todos [alta] CFSE picos representam epítopo células-alvo específicos, enquanto os picos CFSE [baixo] representam alvos pulsadas com peptídeo irrelevante. B) As células CFSE rotulados recuperado da PBS do mouse destinatário imunizadas (Control). C) células CFSE rotulados recuperados a partir de duas diferentes peptídeo ratos destinatário específico, anote os picos diminuiu epítopo específico.
Figura 2. Representação gráfica dos dados analisados. Três pontos de dados apresentados para cada grupo de ratos, PBS, Peptide A, e B. Peptide
| Amostra | CFSE Epitope% ALTA Pulsada | % CFSE LOW Irrelevante | Relação de Baixo: Alta | Matar por cento Epitope específicas |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1,34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1,32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1,26 | 11,74 |
| Um peptídeo | 39,7 | 60,3 | 1,52 | 32,56 |
| Um peptídeo | 38,6 | 61,4 | 1,59 | 35,61 |
| Um peptídeo | 40,6 | 59,4 | 1,46 | 29,99 |
| Peptídeo B | 38,7 | 61,3 | 1,58 | 24,68 |
| Peptídeo B | 38,5 | 61,5 | 1,60 | 25,32 |
| Peptídeo B | 39,3 | 60,7 | 1,54 | 22,76 |
| PBS NT Controle | 47,4 | 52,6 1,11 | ||
| Pep Um Controle NT | 49,4 | 50,6 | 1,02 | |
| Pep B NT Controle | 45,6 | 54,4 | 1,19 |
Tabela 1. Análise de dados representativos. "NT" não é transferido.
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Discussion
Este ensaio pode ser modificado para investigar a capacidade proliferativa das células, incluindo a expansão clonal, porque CFSE relativamente divide igualmente entre os descendentes 10,11. Também é possível usar rotulagem CFSE para investigar a migração celular 6,12, embora existam outras células rastreamento métodos que podem ser mais apropriadas dependendo da hipótese, por exemplo tetrâmeros e bioluminescência 13, que também pode ser combinado com rotulagem CFSE.
É importante notar que sangra CFSE mais em vários canais no citômetro de fluxo, então se você quer co-mancha para um marcador de superfície, PeCy7 seria uma boa escolha de fluoróforo, enquanto PE pode não funcionar tão bem.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Wisconsin-Madison.
Acknowledgments
Gostaria de agradecer a Bianca Mothé, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio por me apresentar ensaios imunológicos e manuseio do mouse. Trabalho no laboratório de GA Splitter é financiado pelo NIH conceder 1-RO1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, e BARD EUA-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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