Summary
Многие инфекции вызывают сильные CTL ответ, но время от времени, количество ответ клеток не коррелирует с контролем патогена
Abstract
Карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFSE) можно использовать, чтобы легко и быстро этикетке клеточной популяции интерес для прижизненного исследования. Это наклеивания этикеток классически были использованы для изучения пролиферации и миграции. В методе, представленных здесь, мы сократили сроки после приемных передачи смотреть на выживание и убийство эпитопа конкретных CFSE меченых клеток-мишеней 4-6. Уровень удельной убийство CD8 + Т-клеток клона может указывать на качество ответа, так как их количество может быть обманчивым. Конкретные CD8 + Т-клеток может стать функционально исчерпаны в течение долгого времени со снижением продукции цитокинов и убийства 7,8. Кроме того, некоторые клоны CD8 + Т-клеток, возможно, не убивать, а также другие с различными TCR особенности 9. Для эффективного иммунитета опосредованного Cell (ММК), антигены должны быть идентифицированы, которые производят не только достаточное число ответ Т-клеток, но и функционально надежный ответ Т-клеток. Здесь мы оцениваем процентов ячейке конкретных убийство двух пептидных специфических Т клеточных клонов в BALB / с мышами.
Protocol
1. Выявление целевой конкретным Эффектор ЦТЛ путем иммунизации (день 0)
- Прежде чем начать, принять решение о конкретных эффекторных: целевой системе. В этом примере классического анализа в естественных условиях CTL, мы будем использовать очищенные пептидные иммунизации для выявления специфических CD8 + Т-клеток. Же пептид будет использоваться для импульса сингенных клетки-мишени, создавая конкретные эффекторных: целевой системе. Кроме того, вы можете использовать весь патогена или белка для получения конкретной эффекторов и задач.
- Обеззараживание внутри рабочей поверхности капота биобезопасности для обеспечения стерильности инъекций. Подготовка пептид иммунизации первого размещения 50 мкг очищенного пептида в 100 мкл 10% ДМСО в PBS / мышь, содержащегося в 2 мл трубки. Затем добавьте равное количество очень холодно неполного адъюванта Фрейнда и до 0,2 мл с маркой 1 мм шарики для перемешивания. С этой точки зрения держать иммуногена на льду до инъекции. Безопасная крышка с парафильмом.
- Используйте шарик било установлено максимальных оборотах смешать эмульсию в течение 3 минут, оперативно размещения эмульсии обратно на лед после смешивания. Полученной эмульсии должны быть одинаковыми по консистенции майонеза. Разрешить эмульсии сидеть при температуре 4 ° С в течение ночи, если позволяет время (до недели), смешивая дальше, если какой-либо разделения отмечается.
- Используйте 1 мл шприца и 20 или 20,5 иглу подтянуть эмульсии будьте осторожны, чтобы не тянуть до любой бусины (бисер должен быть больше, чем датчик иглы, но все-таки быть в курсе).
- Безопасные мыши для подкожного введения в основании хвоста. Мы используем модифицированный пластик 50 мл коническую трубку, чтобы безопасно и мягко обездвижить мыши для инъекций. Inject мышь с 0,2 мл эмульсии.
2. Сбор клеток-мишеней (День 8)
- Вам нужно будет наивным сингенных мышей для вашего клетки-мишени. Эвтаназии наивные мышей в соответствии с AAALAC стандартам.
- Лечить мыши путем распыления 70% этанола, чтобы минимизировать вероятность загрязнения с волос мыши или других внешних загрязнений.
- Использование рассечение ножницами сделать небольшой надрез через кожу на левой стороне мыши. Вытяните кожный лоскут, чтобы раскрыть над перитонеального мешка и внутренних органов.
- Snip через брюшину, стараясь не идти на компромисс любой из основных органов. Селезенка близко к поверхности и похожа по цвету к печени (темно-красный), но меньше и более фасоли в форме. Зараженные мыши обычно показывают в частности селезенки больше, чем здоровые элементы управления.
- Осторожно вытащите селезенки, заботясь, чтобы быть нежными, чтобы не сломать селезенку на несколько частей, чтобы восстановить максимальное количество клеток. Сразу же месте селезенки в 15 мл конические, содержащий 10 мл подготовленной СМИ на льду. Продолжить с остальными мышами.
- Вылейте содержимое 15 мл коническую трубку (средства массовой информации и селезенки) в мясорубку ткани стекла. Grind селезенки использованием большого количества силы верхней части руки. Когда все ткани потеряла свой цвет можно предположить, что вы выздоровели все ячейки из соединительной ткани.
- Вылейте содержимое через мясорубку 70 ячейки фильтра мкм в 50 мл коническую трубку. Промыть мясорубку свежей информации и залить через ячейки сетчатого фильтра.
- Центрифуга при 4 ° С, 1300 RPM в течение 7 минут. Слейте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют в 10 мл лизирующего реагента подготовлены и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 7 минут.
- Добавьте до 50 мл свежей информации и центрифуги, то же самое, что и выше.
- Ресуспендируют в 50 мл свежей информации и центрифуги, то же самое, что и выше (мытье шаг). * Примечание: В это время вы можете выполнять магнитной сепарации ячейки для конкретного типа клеток (например, макрофагов), если чистой популяции клеток-мишеней требуется для передачи в получатель мышей. Кроме того, в это время вы могли бы ввести экспериментальное лечение в культуру, чтобы изучить аффекты, что лечение на клеточном конкретного убийства.
- Граф клетки и пластиной 1 х 10 7 на лунку в 100 мкл в 96 круглых культуре тканей нижней рассматриваются пластины. * Это высокая концентрация клеток / лунку, а потому, что анализ является быстрым, мы видели, без потери жизнеспособности клетки при этой концентрации.
3. Лечение и маркировки клеток-мишеней
- Импульсный соответствующие клетки и репликации с возбудителем конкретного пептида или пептида имеет значения контроля: Добавить 1 мкг / мл пептида. Инкубируйте при 4 ° С в течение 1,5 часов. Переход к 37 ° С инкубатор за последние 30 минут. За это время подготовить CFSE реагента.
- Подготовка CFSE в соответствии с указаниями производителя и разбавить до рабочей концентрации от 0,5 до 25 мкм. Сделать "низкий" концентрации в 10 раз ниже, чем "высокая" концентрация CFSE. Например, для [низкий] добавить 0,5 мкл CFSE до 10 мл PBS и для [высокая], добавляют 5 мкл CFSE до 10 мл PBS. Теплый подготовлены CFSE до 37 ° С до маркировки.
- Удалите пластину клеток из инкубатора и рЭллет в высокой скорости центрифуги при комнатной температуре, 1300 RPM в течение 7 минут. Флик, чтобы удалить супернатант.
- Ресуспендируют клеток либо [низкий] или [высокая] CFSE путем добавления 200 мкл соответствующего реагента в соответствующие лунки и инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 ° C.
- Удалите пластину клеток из инкубатора и снова гранулы при комнатной температуре, 1300 RPM в течение 7 минут. Флик, чтобы удалить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл / лунку нагревается свежей информации и инкубировать 30 минут при температуре 37 ° C.
- Удалите пластину клеток из инкубатора и гранулы при комнатной температуре, 1300 RPM в течение 7 минут. Флик, чтобы удалить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл / лунку PBS.
- Для приемных передачи, добавить одну скважину [низкий] меченых клеток в одной скважине [высокая] меченых клеток на мышь. Результат инъекции должна составлять 50% конкретных задач, а 50% не имеет значения клеток в 0,2 мл.
- Не забудьте выделить некоторые меченых клеток в качестве ваших не передается управление при анализе данных и для работы на поток цитометр (см. Рисунок 1).
4. Приемные передачи
- Обезболить ранее пептид иммунизированных мышей (Из части № 1 этого протокола) в соответствии с AAALAC стандартам.
- Inject 0,2 мл меченых клеток-мишеней с помощью ретроорбитального маршрут в принимающие мышей.
- Подождите 6 часов или других предопределило оптимальное время до эвтаназии получателя мышей.
5. Сбор меченых клеток
* Примечание: Шаги 5,1 через 5,11 такие же, как шаги 2.1 через 2,11
- Граф клеток и пластины из в 1 х 10 6 на лунку в 100 мкл в 96-круглый культуре тканей нижней рассматриваются пластины.
- Fix восстановленные и не передается клетки путем добавления 100 мкл 2% параформальдегида до конечной концентрации 1% параформальдегида во все лунки.
6. Проточной цитометрии и анализа данных
- Выполнить образцов на проточный цитометр и анализа данных.
7. Представитель Результаты
Уменьшение эпитопа конкретных пик на результате гистограмма индикатора клеточной конкретные убийства (рис. 1). Используйте следующие уравнения (применяется в таблице 1), чтобы определить фактическое значение ячейки конкретных лизис:
Ratio = Ненужные Процент: Эпитоп определенный процент ([низкий] пик: [высокая] пик),
Процент Конкретные Лизис = [1 - (не переданных соотношение контроля / Экспериментальное отношение)] х 100
Рисунок 1. CFSE профиля восстановленных BALB / с спленоцитов мыши. Цифры указывают процент клеток высокой или низкой CFSE фенотипа. ) Не передав контроль. Все [высокая] CFSE пики представляют эпитопа конкретные клетки-мишени, в то время [низкий] CFSE пики представляют собой цели, не относящимися к импульсным пептида. Б) CFSE меченых клеток оправился от PBS иммунизированных получателя мыши (Control). С) CFSE меченых клеток оправился от двух различных пептидных конкретных мышей получателя, обратите внимание, уменьшилась эпитопа конкретных пиков.
Рисунок 2. Графическое представление анализируемых данных. Три данных точках, указанных для каждой группы мышей, PBS, пептидов и пептидов B.
| Образец | CFSE ВЫСОКОГО Эпитоп% импульсного | CFSE LOW% Ненужные | Отношение Мин: Высокая | Процент Эпитоп Конкретные Убийство |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1,34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1,32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1,26 | 11,74 |
| Пептид | 39,7 | 60,3 | 1,52 | 32,56 |
| Пептид | 38,6 | 61,4 | 1,59 | 35,61 |
| Пептид | 40,6 | 59,4 | 1,46 | 29,99 |
| Пептида B | 38,7 | 61,3 | 1,58 | 24,68 |
| Пептида B | 38,5 | 61,5 | 1,60 | 25,32 |
| Пептида B | 39,3 | 60,7 | 1,54 | 22,76 |
| PBS NT управления | 47,4 | 52,6 1,11 | ||
| Пеп управления NT | 49,4 | 50,6 | 1,02 | |
| Пеп В NT управления | 45,6 | 54,4 | 1,19 |
Таблица 1. Анализ репрезентативных данных. "НТ" не является переданы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот анализ может быть изменен, чтобы исследовать способность к пролиферации клеток, в том числе клональной экспансии, потому что CFSE делится поровну между относительно потомства 10,11. Кроме того, можно использовать CFSE маркировки для расследования миграции клеток 6,12, хотя Есть другие ячейки методы трассировки, что может быть более подходящим в зависимости от вашей гипотезы, например тетрамеров и биолюминесценции 13, который также может быть объединена с CFSE маркировки.
Важно отметить, что CFSE кровоточит в течение на несколько каналов на проточный цитометр, так что если вы хотите совместно пятно на поверхности маркер, PeCy7 будет хорошим выбором флуорофора, а PE может не работать, а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены. Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) при Университете Висконсин-Мэдисон.
Acknowledgments
Я хотел бы поблагодарить Бьянка Мот, Карла Oseroff, и Мари-Франс DelGuercio для введения мне иммунологических анализов и мышь обработки. Работа в лаборатории Г. А. Splitter финансируется за счет гранта NIH 1-RO1-AI-073558, GLRCE грант 1-U54-AI-057153, а BARD американо-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
