Summary
Muchas infecciones provocan una respuesta CTL fuerte, pero de vez en cuando, la cantidad de células de respuesta no se correlaciona con el control del patógeno
Abstract
Diacetato de carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) puede ser utilizada para etiquetar con facilidad y rapidez una población celular de interés para la investigación en vivo. Este etiquetado tradicionalmente se ha utilizado para estudiar la proliferación y migración. En el método que aquí se presenta, hemos acortado la línea de tiempo después de la transferencia adoptiva de mirar la supervivencia y la muerte de las células CFSE epítopo específico etiqueta meta 6.4. El nivel de muerte específicas de un clon de células T CD8 + pueden indicar la calidad de la respuesta, ya que su cantidad puede ser engañosa. Específicas de células T CD8 + pueden llegar a ser funcionalmente agotado el tiempo con una disminución en la producción de citoquinas y matando a 7,8. Además, ciertos CD8 + clones de células T no se puede matar, así como otras con diferentes especificidades TCR 9. De la inmunidad mediada por células efectiva (CMI), los antígenos deben ser identificados que producen no sólo un número adecuado de responder las células T, sino también funcionalmente robusto responder las células T. Aquí se evalúa la eliminación de las células específicas por ciento de los dos péptidos clones específicos de células T en ratones Balb / c.
Protocol
1. Provocando las metas específicas de Efectos CTL mediante la inmunización (día 0)
- Antes de empezar, decidir sobre un efector específicos: sistema de destino. En este ejemplo de un clásico ensayo in vivo del CTL, vamos a utilizar una vacuna de péptido purificado específico para obtener células T CD8 +. El mismo péptido se utilizará para el pulso de las células diana singénicas, la creación de un efector específicos: sistema de destino. Si lo prefiere, puede optar por utilizar patógeno total o proteínas para obtener su efectores y objetivos específicos.
- Descontaminar la superficie de trabajo en el interior de una campana de bioseguridad para garantizar la esterilidad de las inyecciones. Preparar la vacuna de péptido, en primer lugar la colocación de 50 mg de péptido purificado en 100 l de DMSO al 10% en PBS / ratón en un tubo de 2 ml. A continuación, agregue una cantidad igual de frío adyuvante incompleto de Freund y hasta la marca de 0,2 ml con 1 mm para la mezcla de granos. Desde este punto, mantener inmunógeno en hielo hasta la inyección. Asegure la tapa con Parafilm.
- Use un batidor de cuentas establecido en RPM máximo para mezclar la emulsión durante 3 minutos, inmediatamente la colocación de la emulsión de vuelta en el hielo después de la mezcla. La emulsión resultante debe ser similar en consistencia a la mayonesa. Permita que la emulsión que se siente a 4 ° C durante la noche si el tiempo lo permite (hasta una semana), la mezcla aún más si la separación se nota.
- Use una jeringa de 1 ml y 20 o 20,5 aguja para levantar la emulsión, teniendo cuidado de no tirar las bolas (cuentas debe ser mayor que calibre de la aguja, pero tenga en cuenta).
- Ratón seguro para la inyección subcutánea en la base de la cola. Nosotros usamos un tubo de plástico de 50 ml modificado cónica de manera segura y suave inmovilizar el ratón para inyección. Inyectar el ratón con 0,2 ml de emulsión.
2. Recolección de las células diana (Día 8)
- Usted tendrá que ingenuo ratones singénicos de las células de su objetivo. La eutanasia a los ratones ingenuo de acuerdo con las normas AAALAC.
- Desinfectar el ratón por aspersión 70% de etanol para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación del pelo del ratón u otros contaminantes externos.
- Usando tijeras de disección que cortar pequeños a través de la piel en el lado izquierdo del ratón. Tire de colgajo de piel para descubrir más de saco peritoneal y órganos internos.
- Cortar a través del peritoneo, teniendo cuidado de no comprometer ninguno de los órganos subyacentes. El bazo se encuentra cerca de la superficie y es similar en color al hígado (rojo oscuro), pero más pequeño y más frijol en forma. Los ratones infectados en general, muestran el bazo notablemente mayor que los controles no infectados.
- Retire con cuidado el bazo, teniendo cuidado de ser suave, para no romper el bazo en varias piezas con el fin de recuperar el número máximo de células. Colocar inmediatamente el bazo en una cónica de 15 ml que contienen 10 ml de medio preparado en el hielo. Continuar con los ratones restantes.
- Vierta el contenido del tubo cónico de 15 ml (los medios de comunicación y el bazo) en un triturador de tejidos de vidrio. Triturar el bazo con un montón de fuerza en el brazo superior. Cuando todo el tejido ha perdido su color se puede suponer que se ha recuperado todas las células del tejido conectivo.
- Vierta el contenido del molino a través de un filtro de 70 micras de células en un tubo cónico de 50 ml. Enjuague molino con medio fresco y se vierte a través de un colador de la célula.
- Se centrifuga a 4 ° C, 1300 rpm durante 7 minutos. Elimínese el líquido sobrenadante.
- Resuspender en 10 ml de reactivo de lisis preparado e incubar a 37 º durante 7 minutos.
- Agregue hasta 50 ml con medio fresco y centrifugar, igual que el anterior.
- Resuspender en 50 mL medios de comunicación fresca y centrifugar, igual que el anterior (paso de lavado). * Nota: En este momento se puede realizar una separación de células magnético para un tipo específico de célula (es decir, los macrófagos), si una población de células diana puro se desea para su transferencia a los ratones receptores. Además, en este momento usted podría introducir un tratamiento experimental en la cultura con el fin de estudiar los efectos de que el tratamiento de matar a células específicas.
- Recuento de células y la placa de 1 x 10 7 por pocillo en 100μL de una placa de 96 cultivos de fondo y todo el tejido tratado. * Esta es una alta concentración de células / bien, pero debido a que el ensayo es una labor más rápida, no hemos visto la pérdida de la viabilidad de las células en esta concentración.
3. Tratamiento y etiquetado de las células diana
- Células pulso adecuado y se replica con el péptido patógeno específico o de control de péptido irrelevante: Añadir 1 mg / ml de péptido. Incubar a 4 ° C durante 1,5 horas. Mover a 37 ° C incubadora para los últimos 30 minutos. Durante este tiempo, preparar reactivos CFSE.
- Prepare CFSE de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se diluye a una concentración de trabajo entre 0,5 y 25 micras. Hacer "bajo" la concentración 10 veces menor que la CFSE "alto" de concentración. Por ejemplo, para el [bajo] añadir 0,5 l CFSE a 10 ml de PBS y de [alto], añadir 5 CFSE l de 10 ml de PBS. CFSE calientes preparadas a 37 ° C antes de su etiquetado.
- Retire la placa de las células de la incubadora y el pEllet en una centrífuga de alta velocidad a temperatura ambiente, 1300 rpm durante 7 minutos. Flick para eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en cualquiera de [baja] o [alto] CFSE añadiendo 200 l de reactivo apropiado para los pozos correspondientes y se incuba durante 15 minutos a 37 ° C.
- Retire la placa de las células de la incubadora y el pellet de nuevo a temperatura ambiente, 1300 rpm durante 7 minutos. Flick para eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 200 l / pocillo de medio fresco calentado y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
- Retire la placa de las células de la incubadora y el pellet a temperatura ambiente, 1300 rpm durante 7 minutos. Flick para eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 100 l / pocillo de PBS.
- Para la transferencia adoptiva, añadir un bien [bajo] las células marcadas con un bien [alto] etiquetados células por ratón. Resultante de la inyección debe ser de 50% los objetivos específicos y 50% de células en 0,2 mL irrelevante.
- No te olvides de dejar de lado algunas células marcadas para actuar como su control no transferidos durante el análisis de datos y para el funcionamiento del citómetro de flujo (ver Figura 1).
4. La transferencia adoptiva
- Anestesiar a los ratones inmunizados previamente péptido (Del part # 1 del presente Protocolo), de acuerdo a las normas de AAALAC.
- Inyectar 0,2 mL de las células diana a través de la etiqueta retro-orbital ruta en los ratones receptores.
- Esperar 6 horas o tiempo predeterminado óptima antes de la eutanasia a los ratones receptores.
5. La cosecha células marcadas
* Nota: Los pasos 5.1 a 5.11 son los mismos que los pasos 2.1 a 2.11
- Recuento de células y la placa a la 1 x 10 6 por pozo en 100 L de 96 cultivos de fondo y el tejido alrededor de la placa tratada.
- Fijar las células recuperadas y no transferidos por la adición de 100 l de paraformaldehído al 2% a una concentración final de 1% de paraformaldehído a todos los pocillos.
6. Citometría de flujo y análisis de datos
- Corra las muestras en un citómetro de flujo y análisis de los datos.
7. Resultados representante
Un pico de la disminución de epítopo específico en el histograma resultante es un indicador de la muerte de las células específicas (Figura 1). Use las siguientes ecuaciones (aplicado en la Tabla 1) para determinar el valor real de la lisis de células específicas:
Ratio = Porcentaje irrelevante: Porcentaje epítopo específico (pico [bajo]: [alto] pico),
Porcentaje específico de lisis = [1 - (para no transferir el control de relación / proporción Experimental)] x 100
Figura 1. CFSE perfil de los números de recuperar BALB / c esplenocitos de ratón. Indican el porcentaje de células del fenotipo CFSE alto o bajo. A) no transfirió el control. Todos los [altos] CFSE picos representan epítopo células diana específicas, mientras que [bajo] CFSE picos representan los objetivos de pulso con el péptido irrelevante. B) Las células CFSE etiquetados recuperado de ratón PBS receptor inmunizado (control). C) Las células CFSE etiqueta se recuperó de dos ratones diferentes péptidos destinatario específico, tenga en cuenta los picos de epítopo específico disminuido.
Figura 2. Representación gráfica de los datos analizados. Tres puntos de datos se muestra para cada grupo de ratones, PBS, péptido A, y B. Péptidos
| Muestra | Epítopo CFSE% Pulsada de Alto | CFSE irrelevante% BAJA | Low Ratio: Alto | Matar por ciento epítopo específico |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| Un péptido | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| Un péptido | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| Un péptido | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| Péptido B | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| Péptido B | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| Péptido B | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NT de control | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| Pep Un control de NT | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| Pep B NT de control | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
Tabla 1. El análisis de datos representativos. "NT" no es transferido.
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Discussion
Este ensayo puede ser modificado para investigar la capacidad proliferativa de las células, incluyendo la expansión clonal, porque CFSE relativamente divide en partes iguales entre la progenie 10,11. También es posible utilizar el etiquetado CFSE para investigar la migración de células 6,12, aunque hay otra célula de seguimiento métodos que pueden ser más apropiados en función de su hipótesis, por ejemplo, tetrámeros y bioluminiscencia 13, que también se puede combinar con el etiquetado CFSE.
Es importante tener en cuenta que sangra más CFSE en múltiples canales en el citómetro de flujo, por lo que si desea co-manchas para un marcador de superficie, PeCy7 sería una buena elección de fluoróforo, mientras que el PE no puede funcionar así.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison.
Acknowledgments
Me gustaría agradecer a Bianca Mothé, Oseroff Carla y Marie-France DelGuercio por haberme introducido en ensayos inmunológicos y el manejo del ratón. Trabajar en el laboratorio de GA Splitter es financiado por el NIH subvención 1-SR1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, y BARD Estados Unidos-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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