Summary
Många infektioner framkalla ett starkt CTL svar, men ibland, inte mängden svarar cellerna inte korrelerar till kontroll av den sjukdomsalstrande
Abstract
Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) kan användas för att enkelt och snabbt märka en cellpopulationen för in vivo utredning. Denna märkning har klassiskt använts för att studera spridning och migration. I den metod som presenteras här har vi förkortat tidslinjen efter adoptiv transfer för att titta på överlevnad och dödandet av epitop specifika märkta celler CFSE mål 4-6. Nivån av specifika dödandet av ett CD8 + T-cell klon kan indikera kvaliteten på svaret, eftersom deras kvantitet får vara vilseledande. Särskilda CD8 + T celler kan bli funktionellt utmattad över tiden med en nedgång i cytokinproduktionen och dödar 7,8. Dessutom kan vissa CD8 + T cells kloner dödar inte lika bra som andra med olika TCR särdrag 9. För effektiv cellmedierad immunitet (CMI), måste antigen identifieras som producerar inte bara tillräckligt många svarar T-celler, men också funktionellt robust svarar celler T. Här har vi utvärdera procent cellspecifik dödandet av två peptid specifika kloner T-cell i BALB / c möss.
Protocol
1. Ta fram målspecifik Effektenheter CTL genom immunisering (Dag 0)
- Innan du börjar, besluta om en specifik effektor: målsystemet. I detta exempel på en klassisk in vivo CTL-analysen kommer vi att använda ett renat peptid immunisering för att framkalla specifika CD8 + T-celler. Samma peptid kommer att användas för puls på syngena målceller, inrätta en särskild effektor: målsystemet. Alternativt kan du välja att använda hela patogen eller protein för att få dina specifika effektenheter och mål.
- Sanera insidan arbetet ytan av en biosäkerhet huva för att säkerställa sterilitet injektioner. Förbered peptiden immunisering genom att först placera 50 mikrogram av renat peptid till 100 mikroliter 10% DMSO i PBS / mus i en 2 ml rör. Lägg sedan en lika stor mängd mycket kall Ofullständig Freunds Adjuvant och upp till 0,2 ml märket med 1 mm pärlor för blandning. Från denna punkt, hålla immunogen på is tills injektion. Säkra locket med Parafilm.
- Använd en pärla vispen satt till maximalt varvtal för att blanda emulsionen i 3 minuter, omgående placera emulsionen tillbaka på isen efter blandning. Den resulterande emulsion bör vara lika, konsistens majonnäs. Låt emulsion sitta vid 4 ° C över natten om tiden tillåter (upp till en vecka), mixning ytterligare om någon separation noteras.
- Använd en 1 ml spruta och 20 eller 20,5 nål för att dra upp emulsionen var noga med att inte dra upp några pärlor (pärlor bör vara större än måttet på nålar, men ändå vara medveten).
- Säkra musen för subkutan injektion vid basen av svansen. Vi använder en modifierad plast 50 ml koniska rör för att säkert och försiktigt immobilisera musen för injektion. Injicera musen med 0,2 ml emulsion.
2. Skörd målceller (Dag 8)
- Du behöver naiva syngena möss för din målceller. Euthanize naiva möss enligt AAALAC standarder.
- Desinficera musen genom att spraya 70% etanol för att minimera risken för kontamination från mus hår eller andra yttre föroreningar.
- Använda dissektion sax göra små klipp genom huden på vänster sida av musen. Dra huden lock över att upptäcka peritonealdialys sac och inre organ.
- Klipp genom bukhinnan, försiktigt så att inte äventyra någon av de underliggande organ. Mjälten ligger nära ytan och är liknande i färg till levern (mörk röd), men mindre och mer kidneyböna i form. Infekterade möss visar i allmänhet betydligt större mjälte än oinfekterade kontroller.
- Dra försiktigt ut mjälten, var noga med att vara försiktig för att inte bryta mjälten i flera delar för att få tillbaka maximalt cell nummer. Placera omedelbart mjälten i en 15 ml konisk innehåller 10 ml av beredd media på is. Fortsätt med resterande möss.
- Häll innehållet i 15 ml koniska rör (media och mjälte) i ett glas vävnad kvarn. Slipa mjälten med massor av överarmen styrka. När alla vävnad har förlorat sin färg du kan anta att du har återhämtat alla celler ut i bindväven.
- Häll innehållet i kvarnen genom ett 70 ìm cell filter till en 50 ml koniska rör. Skölj slipmaskin med färska media och häll genom en cell sil.
- Centrifugera vid 4 ° C, 1300 RPM i 7 minuter. Häll bort supernatanten.
- Resuspendera i 10 ml av beredd lyserings reagens och inkubera vid 37 ° i 7 minuter.
- Lägg till upp till 50 MLS med färska media och centrifug, samma som ovan.
- Resuspendera i 50 mls färska media och centrifug, samma som ovan (tvätta steg). * OBS: Vid denna tid kan du utföra en magnetisk cellseparation för en viss celltyp (dvs makrofager) om en ren målcellpopulationen önskas för överföring till mottagare möss. Även vid denna tid kunde man införa en experimentell behandling i kulturen för att studera inverkan av att behandling på cellspecifik döda.
- Räkna celler och platta 1 x 10 7 per väl i 100μL hos en behandlad 96 väl rund botten vävnadskultur plattan. * Detta är en hög koncentration av celler / brunn, men eftersom analysen är en sammanfattning av en, vi har sett utan förlust av livskraften hos de celler vid denna koncentration.
3. Behandling och märkning av målceller
- Puls lämpliga celler och replikerar med patogen specifik peptid eller irrelevanta peptid kontroll: Tillsätt 1 mikrogram / ml peptid. Inkubera vid 4 ° C i 1,5 timmar. Flytta till 37 ° C inkubator för de senaste 30 minuterna. Under denna tid förbereda CFSE reagens.
- Förbered CFSE enligt tillverkarens specifikationer och späd till en fungerande koncentration mellan 0,5 och 25 mikroM. Gör "låga" koncentrationer 10x lägre än "hög" koncentration CFSE. Till exempel för [låg] lägg till 0,5 mikroliter CFSE till 10 mls PBS och för [hög], tillsätt 5 mikroliter CFSE till 10 mls PBS. Varm beredd CFSE till 37 ° C före märkning.
- Ta bort tallrik celler från inkubator och pellet i en hög hastighet centrifug vid rumstemperatur, 1300 RPM i 7 minuter. Flick att ta bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i antingen [låg] eller [hög] CFSE genom att tillsätta 200 mikroliter av lämpliga reagens till motsvarande brunnar och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- Ta bort tallrik celler från inkubatorn och igen pellets vid rumstemperatur, 1300 RPM i 7 minuter. Flick att ta bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 200 mikroliter / brunn av uppvärmd färska media och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Ta bort tallrik celler från inkubatorn och pellets vid rumstemperatur, 1300 RPM i 7 minuter. Flick att ta bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 mikroliter / brunn PBS.
- För adoptiv transfer, lägg till en väl [låg] märkta celler till en väl [hög] märkta celler per mus. Resulterande injektion bör 50% specifika mål och 50% irrelevant celler i 0,2 MLS.
- Glöm inte att avsätta några märkta celler att fungera som din icke-överförda kontroller under analys av data och för att köra på flödescytometern (se figur 1).
4. Adoptiv transfer
- Bedöva tidigare peptid immuniserade möss (från del # 1 i detta protokoll) enligt AAALAC standarder.
- Injicera 0,2 ml av märkta målceller via retro-orbital väg in mottagaren möss.
- Vänta 6 timmar eller andra bestämda optimal tid innan euthanizing mottagaren möss.
5. Skörd Märkta Celler
* Obs: Steg 5,1 via 5,11 är samma som steg 2,1 via 2,11
- Räkna celler och platta ut i 1 x 10 6 per brunn i 100 mikroliter till 96 och rund botten vävnadsodling behandlad plåt.
- Fix återvinns och icke-överförda cellerna genom att tillsätta 100 mikroliter 2% paraformaldehyd till en slutlig koncentration av 1% paraformaldehyd i alla brunnar.
6. Flödescytometri och dataanalys
- Kör prover på en flödescytometer och analysera data.
7. Representativa resultat
En minskande epitop specifik topp på den resulterande histogrammet är en indikator på cellspecifik avlivning (Figur 1). Använd följande ekvationer (som tillämpas i tabell 1) för att fastställa det verkliga värdet av cellspecifik lys:
Ratio = Irrelevant Procent: epitop viss procent ([låg] topp: [hög] topp),
Procent Särskilda Lysis = [1 - (Icke-överfört kontrollen ratio / Experimental ratio)] x 100
Figur 1. CFSE profil av återvunnet BALB / c mus splenocytes. Siffrorna visar procentandel av cellerna i hög eller låg CFSE fenotyp. A) Icke-överförda kontroll. Alla [hög] CFSE topparna representerar epitop specifika målceller, medan [låg] CFSE toppar utgör mål pulsade med irrelevanta peptid. B) CFSE märkta celler återhämtat sig från PBS immuniserats mottagaren musen (Control). C) CFSE märkta celler återhämtat sig från två olika peptid specifik mottagare möss, notera minskat epitopen specifika toppar.
Figur 2. Grafisk representation av analyserade data. Tre datapunkter som visas för varje grupp av möss, PBS, peptid A och Peptide B.
| Exempel på | CFSE HÖG% epitop Pulsed | CFSE LÅG% Irrelevant | Ratio Låg: Hög | Procent epitop Särskilda Killing |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1,34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1,32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1,26 | 11,74 |
| Peptide A | 39,7 | 60,3 | 1,52 | 32,56 |
| Peptide A | 38,6 | 61,4 | 1,59 | 35,61 |
| Peptide A | 40,6 | 59,4 | 1,46 | 29,99 |
| Peptid B | 38,7 | 61,3 | 1,58 | 24,68 |
| Peptid B | 38,5 | 61,5 | 1,60 | 25,32 |
| Peptid B | 39,3 | 60,7 | 1,54 | 22,76 |
| PBS NT kontroll | 47,4 | 52,6 1,11 | ||
| Pep En NT-kontroll | 49,4 | 50,6 | 1,02 | |
| Pep B NT kontroll | 45,6 | 54,4 | 1,19 |
Tabell 1. Analys av representativa uppgifter. "NT" är inte överförs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna analys kan modifieras för att undersöka proliferativ kapacitet i celler, inklusive klonal expansion, eftersom CFSE delar relativt lika mellan avkomma 10,11. Det är också möjligt att använda CFSE märkning för att undersöka cell migration 6,12, men det finns andra celler spåra metoder som kan vara mer lämpliga beroende på din hypotes, exempelvis tetramers och mareld 13, som också kan kombineras med CFSE märkning.
Det är viktigt att notera att CFSE blöder över i flera kanaler på flödescytometern, så om du vill samarbeta färga om att en yta markör, skulle PeCy7 vara ett bra val av fluoroforen, medan PE inte skulle fungera lika bra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Wisconsin-Madison.
Acknowledgments
Jag vill tacka Bianca Mothe, Carla Oseroff, och Marie-France DelGuercio för att införa mig att immunologiska analyser och mus hantering. Arbetet i labbet GA Splitter finansieras av NIH bevilja 1-RO1-AI-073.558, GLRCE bevilja 1-U54-AI-057.153, and Bard USA-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
