Summary
Birçok enfeksiyonları güçlü bir CTL yanıtı ortaya çıkarmak, fakat bazen yanıt hücrelerinin miktarı patojenin kontrol etmek için orantılı değildir
Abstract
Carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (KAKE) kolay ve hızlı bir şekilde in vivo soruşturma ilgi bir hücre popülasyonu etiket kullanılabilir. Bu etiketleme klasik çoğalması ve göç çalışması için kullanılır olmuştur. Burada sunulan yöntem, epitop KAKE etiketli hedef hücreleri 4-6 hayatta kalma ve öldürme bakmak için evlatlık transferinden sonra, zaman çizelgesi kısaltılmış var. Miktarları yanıltıcı olabilir gibi spesifik CD8 + T hücre klonu öldürme seviyesi, kalite yanıt gösterebilir. CD8 + T hücreleri, sitokin üretimi ve öldürme 7,8 düşüş zaman içinde işlevsel olarak tükenmiş olabilir Özgül. Ayrıca, belirli CD8 + T hücre klonlar TCR özgüllükleri 9 farklı yanı sıra diğerleri gibi öldürmek olmayabilir. Etkili Hücre aracılı bağışıklık (CMI), antijenler, T hücreleri yanıt yeterli sayıda sadece üreten tespit değil, aynı zamanda işlevsel olarak sağlam bir yanıt T hücreleri olmalıdır. Burada iki peptid BALB / c farelerde spesifik T hücre klonları yüzde hücre özel öldürme değerlendirir.
Protocol
1. Hedef Özel Efektör CTL'lerin Bağışıklama ortaya çıkartılması (Gün 0)
- Hedef sistemi: başlamadan önce, belirli bir efektör üzerine karar verebilir. Klasik bir in vivo CTL tahlil Bu örnekte, spesifik CD8 + T hücreleri ortaya çıkarmak için saflaştırılmış bir peptid bağışıklama kullanabilirsiniz. Hedef sistemi: Aynı peptid singeneik hedef hücreleri belirli bir efektör yaratarak darbe olacaktır. Alternatif olarak, özel etkileyiciler ve hedefleri elde etmek için tüm patojen veya protein kullanmayı tercih edebilir.
- Enjeksiyonları kısırlık sağlamak için çalışma yüzeyinin bir biyogüvenlik kaput içinde dekontamine. İlk 50 mg, 2 mL tüp içinde yer alan PBS / fare 100 mcL% 10 DMSO peptit saflaştırılmış koyarak peptid bağışıklama hazırlayın. Daha sonra, karıştırma için 1 mm boncuklar ile 0,2 mL işareti ekleyin ve çok soğuk Eksik Freund adjuvan bir eşit miktarda. Bu açıdan bakıldığında, enjeksiyon kadar buz üzerinde immünojen tutmak. Parafilm ile güvenli kapak.
- Derhal karıştırıldıktan sonra buz üzerinde emülsiyon yerleştirerek, 3 dakika boyunca emülsiyon karıştırmak için maksimum RPM'ler ayarlanmış bir boncuk çırpıcı kullanın. Emülsiyon kıvamda mayonez benzer olmalıdır. Emülsiyon 4 oturup ° C gecede herhangi bir ayrılık olduğunu kaydetti zaman izin verir (bir hafta), daha fazla karıştırma. Sağlayın
- Herhangi bir boncuk yukarı çekmeyin dikkatli olmak emülsiyon çekmek için 1 ml şırınga ve 20 veya 20.5 iğne kullanın (boncuklar, iğne, ölçü daha büyük olabilir, ama yine de farkında olmak gerekir).
- Subkutan enjeksiyon için kuyruk dibinde Güvenli fare. Biz, güvenli bir şekilde modifiye edilmiş bir plastik 50 ml konik tüp kullanmak ve yavaşça enjeksiyon için fare hareketsiz. 0,2 ml emülsiyon fare ile enjekte edilir.
2. Hasat Hedef Hücreler (Gün 8)
- Hedef hücreleri için saf singeneik fareler gerekecektir. AAALAC standartlara göre saf fareler Euthanize.
- Fare, fare saç veya diğer harici kirleticiler kontaminasyon riskini en aza indirmek için% 70 Etanol püskürtülerek dezenfekte edin.
- Diseksiyon makas kullanarak farenin sol tarafında deri yoluyla küçük snip olun. Periton kesesi ve iç organlarda ortaya çıkarmak için flep üzerinden çekin.
- Periton yoluyla Snip, dikkatli olmanın temel organlarının herhangi bir taviz vermemek. Dalak, yüzeye yakın ve renkli karaciğer (koyu kırmızı) 'e benzer ama daha küçük ve şekil olarak daha barbunya. Enfekte fareler genellikle enfekte olmamış kontrollere göre özellikle büyük dalak göstermektedir.
- Şekilde maksimum hücre sayıları kurtarmak için çoklu parçalar halinde dalak kırmak için nazik olmaya özen, dalak dikkatlice dışarı çekin. Hemen buz üzerinde hazırlanmış medya 10 mL içeren 15 ml konik dalak yerleştirin. Kalan fare ile devam edin.
- Cam bir doku değirmeni içine 15 ml konik tüp (medya ve dalak) içeriğini dökün. Üst kol gücü bol kullanarak dalak Grind. Tüm doku rengini kaybetti bağ dokusu hücreleri kurtarıldı olduğunu varsayabiliriz.
- 70 mikron hücre filtresi aracılığıyla değirmeni içeriği 50 ml konik bir tüp içine dökün. Değirmeni taze medya ile durulayın ve bir hücre süzgeç vasıtasıyla dökün.
- Santrifüj 4 ° C, 7 dakika için 1300 RPM. Süpernatant kapalı dökün.
- 10 mL reaktif ve 7 dakika 37 ° hazırlanan parçalama inkübe süspanse edin.
- 50 mL kadar taze medya ve santrifüj, yukarıdaki gibi aynı ekleyin.
- 50 mL taze medya ve santrifüj, yukarıdaki gibi aynı (yıkama adım) süspanse edin. * Not: Şu anda saf bir hedef hücre popülasyonunun transferi için alıcı farelere isteniyorsa, belirli bir hücre tipi için bir manyetik hücre ayırma (yani makrofajlar) gerçekleştirebilirsiniz. Ayrıca, şu anda hücre öldürme tedavisinin etkilerini araştırmak için deneysel bir tedavi kültürü haline getirebilir.
- 96 iyi yuvarlak alt doku kültürü tedavi plaka 100μL x 10 7 de ortalama hücreleri ve plaka 1 güvenin. * Bu hücre / iyi bir yüksek konsantrasyon, ancak hızlı bir tahlil, çünkü biz bu konsantrasyonda hücre canlılığı kaybı gördük.
3. Hedef Hücre Tedavi ve Etiketleme
- Darbe uygun hücreleri ve patojen spesifik peptid veya alakasız peptid kontrolü ile çoğaltır: 1 mcg / ml peptid ekleyin. 1.5 saat 4 ° C'de inkübe edin. Son 30 dakika 37 ° C inkübatör taşıyın. Bu süre zarfında KAKE reaktif hazırlamak.
- KAKE üretici özelliklerine göre hazırlayın ve 0.5 ile 25 mcM arasında bir çalışma konsantrasyonu sulandırmak. "Düşük" konsantrasyon "yüksek" konsantrasyon KAKE daha düşük 10x olun. Örneğin, [az] 10 mL PBS 0.5 mcL KAKE ekleyin ve [yüksek], 10 mL PBS 5 mcL KAKE eklemek. Sıcak hazırlanan KAKE 37 ° C etiketleme önce.
- Kuvöz ve p hücreleri plaka çıkarınellet, oda sıcaklığı, 7 dakika için 1300 RPM yüksek hızda santrifüj. Süpernatant kaldırmak Flick.
- [Düşük] veya ilgili kuyulara uygun reaktif 200 mcL ekleme ve 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° [yüksek] KAKE C ya da yeniden süspanse hücreleri
- Oda sıcaklığında, 7 dakika için 1300 RPM, kuvöz ve tekrar pelet hücreleri plaka çıkarın. Süpernatant kaldırmak Flick.
- 200 mcL / iyi ısıtılmış taze medya ve 30 dakika boyunca inkübe yeniden süspanse hücreleri 37 ° C
- Oda sıcaklığında, 7 dakika için 1300 RPM, kuvöz ve pelet hücreleri plaka çıkarın. Süpernatant kaldırmak Flick.
- 100 mcL / iyi PBS içinde süspanse edin hücreleri.
- Evlatlık transferi için, bir de [az] biri etiketli hücreleri [yüksek] fare başına düşen hücreler etiketli. Enjeksiyon sonuçlanan 0,2 mL% 50 belirli hedefleri ve% 50 ilgisiz hücreleri olmalıdır.
- (Bakınız Şekil 1), veri analizi sırasında ve akış sitometresinde çalışan olmayan transfer kontrolleri olarak hareket etmek bazı etiketli hücreler bir kenara bırakarak unutmayın.
4. Evlatlık transferi
- AAALAC standartlarına göre önceden peptid aşı fareler anestezi (part # 1 Bu protokolün).
- 0,2 mL alıcı farelere retroorbital yolla etiketli hedef hücreleri enjekte edilir.
- Alıcı fareler euthanizing 6 saat önce ya da diğer önceden belirlenmiş en uygun zamanı bekleyin.
5. Hasat Etiketli Hücreler
* Not: 5.1 5.11 üzerinden 2.11 üzerinden 2.1 adımları aynı Adımlar
- 96 yuvarlak alt doku kültürü tedavi plaka 100 mcL x 10 6 sıra ortalama 1 hücreleri ve plaka dışarı güvenin.
- Tüm kuyuların% 1 paraformaldehid nihai konsantrasyonu 100 mcL% 2 paraformaldehid ekleyerek kurtarıldı ve non-transfer hücreler sabitleyin.
6. Akım Sitometri ve Veri Analizi
- Bir akış sitometresinde örnekleri çalıştırın ve verileri analiz.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Ortaya çıkan histogram azalan epitop özel zirve hücre belirli bir öldürme (Şekil 1) bir göstergesi. Hücre özel lizis gerçek değerini belirlemek için aşağıdaki denklemler (Tablo 1 uygulanan) kullanın:
Oranı = Alakasız yüzdesi: epitopu Özel Yüzde ([düşük] zirve: [yüksek] pik),
Yüzde Özel Lizis = [1 - (Sigara transfer kontrolü oranı / Deneysel oranı)] x 100
Şekil 1. BALB / c fare dalak kurtarıldı. Numaraları KAKE profili yüksek ya da düşük KAKE fenotipi hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. A) kontrol Sigara transfer. [Düşük] KAKE doruklarına [yüksek] KAKE doruklarına ilgisiz peptit ile darbeli hedefleri temsil ederken, epitop belirli hedef hücreleri temsil eder. B) KAKE etiketli hücreler PBS aşı alıcı fare (Kontrol) kurtarıldı. C) iki farklı peptid özel alıcı fareler kurtarıldı KAKE etiketli hücreleri, azalan epitop özel doruklarına unutmayın.
Şekil 2. Farelerin her grup, PBS, Peptid A ve Peptid B. gösterilen analiz verileri grafiksel gösterimi üç veri noktaları
| Örnek | KAKE YÜKSEK% epitop Pulsed | Alakasız KAKE DÜŞÜK% | Oranı Düşük Yüksek | Yüzde epitop Özel Killing |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1,34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1,32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1,26 | 11,74 |
| Peptid A | 39,7 | 60,3 | 1,52 | 32,56 |
| Peptid A | 38,6 | 61,4 | 1,59 | 35,61 |
| Peptid A | 40,6 | 59,4 | 1,46 | 29,99 |
| Peptid B | 38,7 | 61,3 | 1,58 | 24,68 |
| Peptid B | 38,5 | 61,5 | 1,60 | 25,32 |
| Peptid B | 39,3 | 60,7 | 1,54 | 22,76 |
| PBS NT Control | 47,4 | 52,6 1,11 | ||
| Pep bir NT Kontrol | 49,4 | 50,6 | 1,02 | |
| Pep B NT Kontrol | 45,6 | 54,4 | 1,19 |
Tablo 1. Temsilcisi veri analizi. "NT" olmayan aktarılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KAKE döl 10,11 arasında nispeten eşit böler, çünkü bu testte, klonal genişleme de dahil olmak üzere hücrelerin proliferatif kapasitesi araştırmak için değiştirilebilir. Örneğin tetramers ve biyoparlaklık 13, KAKE etiketleme ile kombine edilebilir hipoteze göre daha uygun olabilir yöntemleri diğer hücre izleme, var olmasına rağmen, hücre göçü 6,12 araştırmak için KAKE etiketleme kullanmak da mümkün.
PE de işe yaramayabilir ise bir yüzey işaretleyici için eş-leke istiyorsanız, bu yüzden bu KAKE kanamaları üzerinde akış sitometresinde birden fazla kanal içine not etmek önemlidir, PeCy7, fluorofor iyi bir seçim olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti. Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bianca MOTHE Carla Oseroff ve Marie-France DelGuercio immünolojik testleri ve fare kullanımı için beni tanıştırdığı için teşekkür etmek istiyorum. GA Splitter laboratuarda çalışma NIH hibe 1-RO1-AI-073.558, GLRCE hibe 1-U54-AI-057.153, BARD ABD-3829-06 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.
