Summary
De nombreuses infections provoquent une forte réponse CTL, mais parfois, la quantité de cellules répondant n'est pas en corrélation au contrôle de l'agent pathogène
Abstract
Carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) peut être utilisé facilement et rapidement l'étiquette d'une population cellulaire d'intérêt pour l'enquête in vivo. Cet étiquetage a été classiquement utilisé pour étudier la prolifération et la migration. Dans la méthode présentée ici, nous avons raccourci les délais, après le transfert adoptif de regarder la survie et la mort de cellules CFSE épitope spécifique cible marquée 4-6. Le niveau de destruction spécifique d'un clone cellulaire T CD8 + peuvent indiquer la qualité de la réponse, que leur quantité peut être trompeur. Spécifiques cellules T CD8 + peuvent devenir fonctionnellement épuisées au cours du temps avec une baisse de la production de cytokines et de tuer 7,8. En outre, certains clones CD8 + des lymphocytes T ne peut pas tuer ainsi que d'autres avec différentes spécificités TCR 9. Pour immunité à médiation cellulaire efficace (CMI), les antigènes doivent être identifiés qui produisent non seulement un nombre suffisant de répondre cellules T, mais aussi fonctionnellement robustes cellules T répondant. Ici nous évaluons la destruction des cellules spécifiques de deux pour cent peptide spécifique des clones de lymphocytes T dans souris Balb / c.
Protocol
1. Solliciter la cible des CTL spécifiques effectrices par la vaccination (jour 0)
- Avant de commencer, décider d'un effecteur spécifique: le système cible. Dans cet exemple d'un classique in vivo de CTL dosage, nous allons utiliser une vaccination peptide purifié à susciter spécifiques des cellules T CD8 +. Le même peptide sera utilisé pour les cellules cibles d'impulsion syngéniques, la création d'un effecteur spécifique: le système cible. Alternativement, vous pouvez choisir d'utiliser tout ou protéines pathogènes pour obtenir votre effecteurs et cibles spécifiques.
- Décontaminer la surface de travail à l'intérieur d'un capot de biosécurité afin de garantir la stérilité des injections. Préparer la vaccination peptide en plaçant d'abord 50 mg de peptide purifiés en 100 uL DMSO 10% dans du PBS / souris contenue dans un tube de 2 mL. Ensuite, ajoutez une quantité égale de très froid adjuvant incomplet de Freund et jusqu'à la marque 0,2 ml avec 1 mm pour le mélange des perles. De ce point, garder immunogène la glace jusqu'à l'injection. Couvercle sécurisé avec du parafilm.
- Utilisez un batteur perles mis à RPM maximal de mélanger l'émulsion pendant 3 minutes, rapidement placer l'émulsion retour sur la glace après le mélange. L'émulsion résultante devrait être similaire en consistance à la mayonnaise. Autoriser émulsion de s'asseoir à 4 ° C pendant la nuit, si le temps le permet (jusqu'à une semaine), en mélangeant encore si toute séparation est noté.
- Utiliser une seringue de 1 mL et de 20 ou 20,5 aiguille de la jauge de remonter d'émulsion en faisant attention à ne pas tirer vers le haut toute perles (perles doit être supérieure à calibre de l'aiguille, mais toujours être au courant).
- La souris sécurisé pour injection sous-cutanée à la base de la queue. Nous utilisons un plastique de 50 ml modifiés tube conique en toute sécurité et en douceur d'immobiliser la souris pour l'injection. Injecter la souris avec 0,2 mL d'émulsion.
2. Cellules cibles de récolte (Jour 8)
- Vous aurez besoin de souris syngéniques naïves pour vos cellules cibles. Euthanasier souris naïves conformément aux normes AAALAC.
- Désinfectez la souris par pulvérisation d'éthanol à 70% afin de minimiser les risques de contamination à partir des cheveux de souris ou d'autres contaminants extérieurs.
- Avec des ciseaux de dissection font snip petits travers de la peau sur le côté gauche de la souris. Tirez lambeau de peau plus à découvrir sac péritonéal et les organes internes.
- Snip à travers le péritoine, en faisant attention de ne pas compromettre l'un des organes sous-jacents. La rate est proche de la surface et est similaire en couleur pour le foie (rouge foncé) mais plus petite et plus de haricots de rein en forme. Les souris infectées montrent généralement plus grandes que la rate, notamment des témoins non infectés.
- Retirez doucement la rate, en prenant soin d'être doux pour ne pas briser la rate en plusieurs morceaux afin de récupérer au maximum le nombre de cellules. Placer immédiatement la rate dans une conique 15 ml contenant 10 ml de milieux préparés sur la glace. Continuer avec les souris restantes.
- Verser le contenu du tube 15 ml conique (médias et la rate) dans un broyeur de tissus de verre. Broyer la rate en utilisant beaucoup de force du bras. Lorsque tout le tissu a perdu sa couleur, vous pouvez supposer que vous avez récupéré toutes les cellules de tissu conjonctif.
- Verser le contenu de la meuleuse à travers un filtre 70 microns de cellules dans un tube conique de 50 ml. Rincez meuleuse avec les médias fraîche et versez dans une passoire cellule.
- Centrifuger à 4 ° C, 1300 RPM pendant 7 minutes. Verser le liquide surnageant.
- Remettre en suspension dans 10 ml de réactif de lyse préparé et incuber à 37 ° pendant 7 minutes.
- Ajoutez jusqu'à 50 ml avec les médias frais et centrifugeuse, comme ci-dessus.
- Remettre en suspension dans les médias MLS 50 frais et centrifugeuse, le même que ci-dessus (étape de lavage). * Remarque: En ce moment vous pouvez effectuer une séparation magnétique de cellules d'un type de cellule spécifique (les macrophages par exemple), si une population cible de cellules pures est souhaitée pour le transfert dans des souris receveur. Aussi, à ce moment vous pouvez introduire un traitement expérimental dans la culture afin d'étudier les effets de ce traitement sur la destruction spécifique des cellules.
- Compter les cellules et la plaque 1 x 10 7 par puits dans 100 ul dans une plaque 96 puits de culture tissulaire rondes en bas traitées. * Ceci est une forte concentration de cellules / puits, mais parce que le dosage est un rapide, nous n'avons vu aucune perte de viabilité des cellules à cette concentration.
3. Traitement et marquage des cellules cibles
- Pulse cellules appropriées et reproduit avec le peptide d'organismes pathogènes spécifiques ou de contrôle peptide non pertinent: Ajouter 1 ug / ml de peptide. Incuber à 4 ° C pendant 1,5 heures. Déplacer à 37 ° C incubateur pour durer 30 minutes. Pendant ce temps préparer le réactif CFSE.
- Préparer CFSE selon les spécifications du fabricant et diluer à une concentration de travail entre 0,5 et 25 um. Faire «faible» de concentration 10x plus faible que la concentration CFSE «élevé». Par exemple, pour [faible] ajouter 0,5 uL CFSE à 10 ml de PBS et pour [haute], ajouter 5 uL CFSE à 10 ml de PBS. CFSE chaud préparé à 37 ° C avant d'étiquetage.
- Retirer la plaque de cellules de l'incubateur et pEllet dans une centrifugeuse à grande vitesse à la température ambiante, 1300 RPM pendant 7 minutes. Flick pour enlever le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans les deux [faible] ou [haute] CFSE en ajoutant 200 ul de réactif appropriés dans les puits correspondants et incuber pendant 15 minutes à 37 ° C.
- Retirer la plaque de cellules de l'incubateur et encore de bouletage à température ambiante, 1300 RPM pendant 7 minutes. Flick pour enlever le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 200 ul / puits de réchauffé milieux frais et incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
- Retirer la plaque de cellules provenant de pépinière et de culot à température ambiante, 1300 RPM pendant 7 minutes. Flick pour enlever le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 100 ul / puits de PBS.
- Pour le transfert adoptif, ajoutez un puits [faible] cellules marquées d'un puits [haute] cellules marquées par souris. Résultant d'injection devrait être de 50% des objectifs spécifiques et 50% des cellules sans pertinence dans 0,2 ml.
- Ne pas oublier de mettre de côté certaines cellules marquées d'agir comme vos contrôles non transférés lors de l'analyse des données et pour l'exécution sur le cytomètre en flux (voir figure 1).
4. Le transfert adoptif
- Anesthetize préalablement peptide souris immunisées (de la partie # 1 du présent protocole) conformément aux normes AAALAC.
- Injecter 0,2 ml de cellules cibles marquées par rétro-orbitaires itinéraire dans souris receveuses.
- Attendre 6 heures ou toute autre durée prédéterminée optimale avant euthanasier les souris receveuses.
5. Récolte cellules marquées
* Remarque: Les étapes 5.1 à 5.11 sont les mêmes que les étapes 2.1 à 2.11
- Compter les cellules et la plaque à moins 1 x 10 6 par puits dans 100 ul en 96 culture sur le fond de tissu bien ronds plaque traitée.
- Fixer les cellules récupérées et non transférés en ajoutant 100 uL paraformaldéhyde 2% à une concentration finale de paraformaldéhyde 1% à tous les puits.
6. Cytométrie en flux et analyse de données
- Exécuter des échantillons sur un cytomètre en flux et analyser les données.
7. Les résultats représentatifs
Un pic épitope diminution spécifique sur l'histogramme qui en résulte est un indicateur de la destruction spécifique des cellules (figure 1). Utilisez les équations suivantes (appliquée dans le tableau 1) pour déterminer la valeur réelle de lyse spécifique des cellules:
Ratio = Pourcentage pertinent: Epitope pourcentage déterminé (pic [faible]: [haute] de pointe),
Lysis pour cent spécifique = [1 - (rapport de contrôle non-transfert / rapport expérimental)] x 100
Figure 1. Profil CFSE des numéros récupérés splénocytes de souris Balb / c. Indiquer le pourcentage de cellules de phénotype CFSE haute ou basse. A) Non-transfert de contrôle. Tous [haute] CFSE pics représentent épitope des cellules cibles spécifiques, tandis que [faible] pics CFSE représentent des cibles pulsées avec le peptide non pertinentes. B) les cellules CFSE étiquetés récupéré de la souris immunisées bénéficiaires PBS (contrôle). C) les cellules CFSE étiquetés récupéré de deux souris différentes peptide destinataire spécifique, notez les pics épitope diminuée précises.
Figure 2. Représentation graphique des données analysées. Trois points de données indiqué pour chaque groupe de souris, PBS, peptide A et B. Peptide
| Exemple | Epitope% CFSE HAUTE pulsé | % CFSE BASSE Irrelevant | Low Ratio: High | Tuer pour cent Epitope spécifiques |
| PBS | 42,8 | 57,2 | 1,34 | 16,97 |
| PBS | 43,1 | 56,9 | 1,32 | 15,94 |
| PBS | 44,3 | 55,7 | 1,26 | 11,74 |
| Peptide A | 39,7 | 60,3 | 1,52 | 32,56 |
| Peptide A | 38,6 | 61,4 | 1,59 | 35,61 |
| Peptide A | 40,6 | 59,4 | 1,46 | 29,99 |
| Peptide B | 38,7 | 61,3 | 1,58 | 24,68 |
| Peptide B | 38,5 | 61,5 | 1,60 | 25,32 |
| Peptide B | 39,3 | 60,7 | 1,54 | 22,76 |
| PBS NT contrôle | 47,4 | 52,6 1,11 | ||
| Pep Un contrôle NT | 49,4 | 50,6 | 1,02 | |
| Pep B NT contrôle | 45,6 | 54,4 | 1,19 |
Tableau 1. Analyse des données représentatives. "NT" est non-transfert.
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Discussion
Ce dosage peut être modifié pour enquêter sur la capacité proliférative des cellules, y compris l'expansion clonale, parce CFSE divise de façon relativement égale parmi les descendants 10,11. Il est également possible d'utiliser l'étiquetage CFSE pour enquêter 6,12 migration cellulaire, mais il existe d'autres cellules de traçage des méthodes qui peuvent être plus appropriés en fonction de votre hypothèse, pour les tétramères exemple et bioluminescence 13, qui peut également être combiné avec l'étiquetage CFSE.
Il est important de noter que saigne CFSE plus dans des canaux multiples sur le cytomètre en flux, donc si vous souhaitez co-taches pour un marqueur de surface, PeCy7 serait un bon choix de fluorophore, tandis que PE ne pourrait pas fonctionner aussi bien.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Wisconsin-Madison.
Acknowledgments
Je tiens à remercier Bianca Mothe, Carla Oseroff, et Marie-France DelGuercio pour me présenter à des tests immunologiques et de manipulation de la souris. Le travail dans le laboratoire de GA Splitter est financé par les NIH-RO1 subvention de 1-AI-073 558, GLRCE subvention de 1-U54-AI-057 153, et Bard US-3829-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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