Summary
In diesem Video zeigen wir, wie man einen Leitwert in einem dopaminergen Neuronen in der ganzen Zelle Konfiguration in Hirnschnitten der Ratte festgestellt werden. Diese Technik nennt man das dynamische Klemme.
Abstract
Neurowissenschaftler untersuchen die Funktion des Gehirns durch die Untersuchung, wie Nervenzellen im Gehirn kommunizieren. Viele Forscher betrachten Veränderungen in der elektrischen Aktivität eines oder mehrerer Neuronen in Reaktion auf eine experimentell-Eingang auf. Die elektrische Aktivität der Neuronen kann in isolierten Hirnschnitten mittels Patch-Clamp-Techniken mit Glasmikropipetten aufgezeichnet werden. Traditionell können Experimentatoren neuronalen Input durch direkte Injektion der aktuellen imitieren durch die Pipette, die elektrische Stimulation des anderen Zellen oder verbleibende axonalen Verbindungen in der Scheibe, oder pharmakologische Manipulation durch Rezeptoren auf der neuronalen Membran der aufgenommenen Zelle.
Gleichstrom Injektion hat den Vorteil, daß man eine vorgegebene Stromform mit hoher zeitlicher Präzision auf dem Gelände der Aufnahme (in der Regel die Soma). Allerdings ist es nicht ändern, der Widerstand der neuronalen Membran, da keine Ionenkanäle physisch geöffnet werden. Aktuelle Injektion in der Regel beschäftigt Rechteckimpulse und damit nicht-Modell die Kinetik der Ionenkanäle. Schließlich können Stromeinspeisung nicht imitieren die chemischen Veränderungen in der Zelle, die mit der Öffnung von Ionenkanälen auftritt.
Rezeptoren können physikalisch durch elektrische oder pharmakologische Stimulation aktiviert werden. Der Versuchsleiter hat eine gute zeitliche Präzision der Rezeptoraktivierung mit elektrischer Stimulation der Scheibe. Allerdings gibt es nur begrenzte räumliche Präzision der Rezeptor-Aktivierung und die genaue Natur dessen, was nach Stimulation aktiviert ist unbekannt. Das letztere Problem kann teilweise durch spezifische pharmakologische Wirkstoffe gelindert werden. Leider ist der zeitliche Verlauf der Aktivierung von pharmakologischen Wirkstoffen in der Regel langsam und die räumliche Genauigkeit der Eingänge auf die aufgenommenen Zelle ist unbekannt.
Die dynamische Clamp-Technik ermöglicht ein Experimentator auf die aktuelle Veränderung gingen direkt in die Zelle basierend auf Echtzeit-Feedback der Membran der Zelle (Robinson und Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Für eine Übersicht siehe Prinz et al. 2004). Dies ermöglicht ein Experimentator auf der elektrischen Veränderungen, die auf dem Gelände der Aufnahme treten als Reaktion auf die Aktivierung des Rezeptors zu imitieren. Real-time Veränderungen in der angewandten Strom werden durch eine mathematische Gleichung in Hardware implementiert bestimmt.
Wir haben vor kurzem die dynamische Clamp-Technik verwendet, um die Erzeugung von Bursts von Aktionspotentialen durch phasische Aktivierung von NMDA-Rezeptoren in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009.; Lobb et al, 2010.) Zu untersuchen. In diesem Video zeigen wir die Verfahren benötigt, um eine NMDA-Rezeptor-Leitwert in einer dopaminergen Neuronen gelten.
Protocol
1. Slice-Vorbereitung
- Cut Hirnschnitten mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotom. Wir bereiteten 240 um horizontale Mittelhirn Scheiben aus einer Isofluran-anethetized Sprague-Dawley Ratten (Charles River Laboratories) mit einem vibrierenden Mikrotom (Microm HM 650V) im Einklang mit der University of Texas at San Antonio Institutional Animal Care und Verwenden Committee.
- Halten Sie die Scheiben in eine Inkubationskammer, bis Sie zur Aufnahme bereit sind. Wir verwenden eine Inkubationszeit Behälter erwärmt auf 32 ° C und mit künstlicher Liquor (aCSF; in mM): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 Dextrose, 25 NaHCO 3, 1,3 Ascorbinsäure, 2,4 Natriumpyruvat und 0,05 Glutathion.
2. Elektrophysiologische Recording
- Übertragen Sie die Scheibe, um die intrazelluläre Aufnahme rig, in denen eine künstliche Liquor (aCSF) bei 35 ° C wird durchblutet ist. Wir benutzen die gleichen aCSF wie in 1.2, außer dass 2 mM MgCl 2 verwendet wurde und Glutathion wurde verzichtet. Für horizontal vorbereitet Scheiben, wir in der Regel halbieren die Scheibe entlang der Mittellinie.
- Visualisieren Sie die Zielneuron. Wir visualisieren einzelnen Substantia nigra dopaminergen Neuronen mit einem Gradienten Gegensatz Imaging-System.
- Ziehen Sie eine Elektrode mit einem elektronischen Elektrode Abzieher. Wir ziehen Elektroden mit einer Spitze Widerstand von 4-10 MOhm mit einer P97 Micropipette Puller (Sutter Instrument Company).
- Füllen Sie eine Elektrode mit der gewünschten internen Lösung. Wir verwenden eine Lösung, die (in mM): 138 K-Gluconat, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. Die interne Lösung wurde auf einen pH von 7,3 mit 1 M KOH und einer Osmolarität von 270-275 mOsms angepasst.
- Machen Sie eine Gigaohm Dichtung auf die gewünschte Neuron. Rupture die Dichtung mit Absaugung. Dies stellt eine ganze Zelle Aufnahme. Ein Multiclamp 700B Verstärker wurde in unserer Konfiguration verwendet. Der Verstärker sollte dann in Stromzange die "I = 0"-Modus versetzt werden.
3. Leitwert Anwendung mit Dynamic Clamp
- RTXI (www.rtxi.org) wurde auf dem dynamischen Clamp-Computer ausgeführt. Eine benutzerdefinierte geschrieben Modell mit einem NMDA-Rezeptor wurde in den Speicher geladen. Der Strom in der Zelle in Echtzeit injiziert wird durch die folgende Gleichung berechnet:
Ich NMDA =-g NMDA * [1 / (1 + ([Mg] / 3,57) * e (-V m * 0,062))] * (V m - E NMDA), wo g NMDA ist die gewünschte Leitfähigkeit (in nS; standardmäßig auf 0 gesetzt nS), [Mg] ist die Magnesium-Konzentration (auf 1,5 mm in unserem Beispiel unten), ist E NMDA die Umkehrung Potenzial für den NMDA-Rezeptor (auf 0 mV) und V m wird das Membranpotential der Zelle aus dem Verstärker gemessen (in Millivolt). - Der Ausgang aus der dynamischen Clamp-Computer wurde die Command-Eingang des Verstärkers über einen Analog-Digital-Wandler verbunden.
- Der Verstärker wurde in Stromzange der "IC"-Modus versetzt.
- Geben Sie die gewünschte NMDA-Rezeptor-Leitwert in RTXI (zB 40ns). Sie sollten eine phasische Burst von Aktionspotentialen. Alternativ kann eine Leitfähigkeit bis RTXI über einen analogen Ausgang (Abbildung 1A, 'g (t)') angegeben werden. Eine entsprechende Skalierungsfaktor muss innerhalb RTXI verwendet werden, um das Signal von Volt an Siemens zu konvertieren.
4. Repräsentative Ergebnisse
Ein erfolgreiches Setup für die Anwendung einer Leitfähigkeit unter Verwendung der dynamischen Klammer ist in Abbildung 1A dargestellt. Mit diesem Setup haben wir eine ganze Zelle somatischen Aufnahme von einem dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra pars compacta. Dopaminergen Zellen in der Regel spontan Feuer zu günstigen Preisen mit einem Herzschrittmacher-ähnliches Muster. Ein Burst von Aktionspotentialen kann durch phasische Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert mit dynamischen Klemme (Abbildung 1B) hervorgerufen werden.
Abbildung 1: Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert mit dem dynamischen Clamp-Technik. A. Hardware-Setup, welches die Verbindungen zwischen den intrazellulären Aufnahme rig und dynamische Clamp-Computer. B. Ein Burst von Aktionspotentialen wird durch Anwendung eines 40ns NMDA-Rezeptor-Leitwert in einer ganzen Zelle Aufnahme von einem Substantia nigra pars compacta dopaminergen Neuronen hervorgerufen werden.
Discussion
Die dynamische Clamp-Technik demonstriert hier eine Verbesserung gegenüber der traditionellen Technik der direkten Stromeinspeisung, indem der Experimentator die elektrischen Effekte der Aktivierung eines Rezeptors zu imitieren. In diesem Video haben wir gezeigt, dass man die Effekte hinzufügen Aktivierung von NMDA-Rezeptor, die spontane Aktivität der dopaminergen Neuronen, dh ein Platzen der Aktionspotentiale hervorgerufen werden.
Durch die Flexibilität der Hardware / Software-Implementierung kann eine Vielzahl von Erweiterungen verwendet werden. Das Zeichen des injizierten Strom von negativ auf positiv geschaltet werden, was einem Szenario, in dem die Auswirkungen der aktivierten Rezeptor von einem Neuron entfernt wird. Modell Neuronen, in Form einer Reihe von Differentialgleichungen dargestellt werden, können auch numerisch gelöst werden und erlauben es dem Forscher, kleine Netzwerke zu untersuchen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von MH084494 (CJL) und MH079276 und NS060658 (GAP) unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
| Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus Corporation | ||
| 2 A/D converters | Equipment | Any Supplier | ||
| Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Equipment | Triview |
References
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
