Summary
هيكل 3 - D من جزيء يوفر فريدة من فهم كيفية عمل الجزيء. الأسلوب الرئيسي للتقرير في بنية شبه الذرية القرار البلورات بالأشعة السينية. هنا ، علينا أن نظهر أن الأساليب الحالية للحصول على بلورات ثلاثي الأبعاد للجزيء أي بالنظر إلى أن تكون مناسبة لتحديد الهيكل بواسطة البلورات بالأشعة السينية.
Abstract
باستخدام هيكل ثلاثى الابعاد لجزيئات بيولوجية لاستنتاج كيفية عملها هو واحد من أهم مجالات البيولوجيا الحديثة. توافر هياكل ذرية القرار يوفر فهما عميقا وفريدة من نوعها وظيفة البروتين ، ويساعد على كشف الأعمال الداخلية للخلية الحية. حتى الآن ، 86 ٪ من بنك معلومات البروتين (rcsb - PDB) الإدخالات هياكل الجزيئات التي تم تحديدها باستخدام الأشعة السينية البلورات.
للحصول على بلورات المناسبة للدراسة البلورات ، ويجب أن جزيء (بروتين مثل الحمض النووي ، ومعقدة البروتين البروتين أو البروتينات والحمض النووي معقد) يمكن تنقيته لالتجانس ، أو أقرب ما يمكن إلى التجانس. تجانس إعداد يشكل عاملا رئيسيا في الحصول على البلورات التي حيد الضوء إلى ارتفاع القرار (Bergfors ، 1999 ؛ ماكفرسون ، 1999).
يتطلب بلورة يصل إلى جزيء فوق التشبع. ولذلك ينبغي أن تتركز العينة إلى تركيز أعلى درجة ممكنة من دون التسبب في سقوط الأمطار أو تجميع للجزيء (عادة 20-50 ملغ / مل). ويمكن تقديم نموذج لتعزيز عامل عجل التنوي من البلورات البروتينية في الحل ، والذي يمكن أن يؤدي إلى بلورات ثلاثي الأبعاد الكبيرة المتزايدة من الحل. هناك نوعان من التقنيات الرئيسية للحصول على بلورات : بخار نشر وبلورة الدفعي. نشر في بخار ، وانخفاض تحتوي على خليط من حلول مرسب والبروتين هو في غرفة مغلقة مع مرسب النقي. ثم ينشر بخار الماء من الانخفاض حتى الأسمولية من الانخفاض ومرسب متساوون في (الشكل 1A). والجفاف من الانخفاض البطيء يؤدي إلى تركيز كل من البروتين ومرسب حتى يتحقق التوازن ، مثالي في منطقة التنوي الكريستال من المخطط المرحلة. الأسلوب يعتمد على تقديم دفعة البروتين مباشرة في منطقة التنوي بواسطة بروتين الاختلاط مع كمية مناسبة من مرسب (1B الشكل). عادة ما يتم إجراء هذه الطريقة في ظل البارافين / خليط المعادن النفطية للحيلولة دون انتشار المياه من الهبوط.
هنا سوف نظهر نوعين من الإعداد لنشر بخار التجريبية ، والشنق قطرة قطرة ، والجلوس ، وبالإضافة إلى بلورة إطار الدفعة النفط.
Protocol
المواد :
- عينة بروتين -- الليزوزيم (50 ملغ / مل)
- شنق 24 قطرة جيدا صينية
- يجلس جيدا انخفاض 24 علبة
- Microbatch تبلور 96 علبة جيدا
- بلورة حلول (إما التجارية المتاحة أو المنزل الذي أدلى)
- السيليكون الشحوم
- 5 مل حقنة دون Luer القفل
- تغطية الشرائح Siliconized
- ختم الشريط الضوئي
- البارافين
- 0،1-2 micropipette ميكرولتر مع الاحتفاظ المنخفض نصائح
- ملاقيط
- مناديل المهنية
1. معلقة / يجلس إسقاط الإجراءات :
- للحصول على شاشة الأولي يمكن للمرء أن استخدام الشاشات المتوفرة تجاريا التي تستغل مصفوفة كاملة متفرق الأسلوب مضروب ظروف المحاكمة. غير منحازة مصفوفة كاملة متفرق مضروب من قبل وطريقة اختيارهم من الشروط المعروفة للتبلور جزيئات (كارتر وكارتر ، 1979 ؛ Cudney وآخرون ، 1994 ؛. Jancarik وكيم ، 1991 ؛. Jancarik وآخرون ، 1991). إذا كان من المعروف مسبقا حالة التبلور ، يمكن تجميعها شاشة ضيقة ، بدرجات تركيز الرواسب ودرجة الحموضة في جميع أنحاء ضرب الأصلي. ومرسب أنجح شيوعا هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ، تليها سلفات الأمونيوم. معا ، هذه precipitants حساب اثنين من أجل ما يقرب من 60 ٪ من جميع الجزيئات precipitants المسجلة المستخدمة لبلورة (جيليلاند وآخرون ، 1994 ؛. كيمبر وآخرون ، 2003 ؛. صفحة وآخرون ، 2003).
- إعداد الحلول بلورة الخاص. وعادة ما يتم الجمع بين هذه الظروف من وكيل عجل ، والملح من نوع ما وعازلة لضبط درجة الحموضة. قد يكون في بعض الحالات واضاف المضافة خصيصا لهذا البروتين في المصالح. ينبغي تصفيتها حل جميع الأسهم باستخدام 0.22 ميكرون التصفية. ربما بعض من محلول المخزون تكون لزجة جدا (50 ٪ أوتاد ، الجلسرين ، PEG - MME ، الخ).
- إعداد 1.5 مل من 0.6 ، 0.8 ، 1.0 ، 1.2 ، 1.4 ، 1.6 م في كل من كلوريد الصوديوم 0.1 درجة الحموضة NaOAc M 4.0 ، 4.3 ، 4.6 و 4.9 (حلول مجموعه 24)
- أذاب عينتك البروتين والحفاظ على الجليد. يجب أن يتم تخزينها في مخزونات البروتين -80 درجة مئوية ما لم البروتين ذات الاهتمام حساس لتجميد / دورات الذوبان (إذا كان الأمر كذلك ، وتخزينها في 4 درجات مئوية). تركيزات البروتين النموذجية هي في حدود 50-50 ملغ / مل ، مع ارتفاع تركيزات عادة إعطاء أفضل النتائج.
- تدور العينة 15min/18 ، 000xg / 4 درجات مئوية -- تميل بعض البروتينات لتجميع جزئيا ويعجل بعد خطوة ذوبان الجليد. ويمكن تعزيز هذه المجاميع هطول الأمطار غير متبلور من بقية الجزيئات البروتينية لذا تدور باستمرار شامل يضمن لديك سوى جزيئات تذوب في عينتك. إبقاء البروتين على الجليد حتى إعداد الدرج.
- تحديد تركيز البروتين من الامتصاصية أعمالها في 280 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن حساب تركيز البروتين من القراءة الامتصاصية ومعامل البروتين الانقراض. ويمكن حساب معامل الانقراض مع أداة ProtParam على موقع Expasy : http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- تملأ الآبار من جانب شنقا 24 / علبة قطرة الجلوس مع 500 ميكرولتر من محلول مرسب وفقا لخطة الإعداد علبة (الشكل 2B). إنشاء عصابة الشحوم سيليكون حول حافة البئر. وينبغي أن يكون حلقة فجوة صغيرة لمنع تراكم الضغط الجوي كما هو مختومة البئر. قطرات في الجلوس ، وليس هناك حاجة لأن الشحوم لاغلاق جيدا مع الشريط (الشكل 2A).
- تأخذ شريحة الغطاء وتنظيفه مع رذاذ الهواء المكثف ، أو مسح المهنية -- تجنب الغبار سيخفف تفسير انخفاض التلوث والقضاء على التبلور. قطرات للجلوس ، لا يتم استخدام الشريحة الغطاء. بدلا من ذلك ، كذلك يحتوي على الرف الذي يتم خلط البروتين ومرسب.
- طرح كميات متساوية من العينة البروتين وخزان حل على الشريحة الغطاء. لا يجوز محاكمة أحجام مختلفة من البروتين ومرسب كجزء من عملية التحسين. استخدام المزيد من البروتين من النتائج مرسب في تركيز صافي البروتين في الانخفاض بعد موازنة ، التي يمكن أن يكون من المرغوب فيه للحصول على عينات البروتين المخففة ، وإبطاء التنوي الكريستال أو النمو. وسيتم أيضا أي مادة أخرى غير قلق في حل قطرة أن تتركز من قبل العامل نفسه. عندما pipetting البروتين والحلول الخزان على الشريحة الغطاء ، نكون حذرين للغاية لتجنب تكوين الفقاعة. هذا يحدث غالبا عندما يتم نفخ الهواء من ماصة.
- قطرة شنقا : تحميل 2 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الليزوزيم 0.02 درجة الحموضة في NaOAc M 4.9 إلى وسط تغطية الشريحة وإضافة إلى ذلك 2 ميكرولتر من الحل الخزان.
- يجلس قطرة : تحميل 2 ميكرولتر من 50 حل الليزوزيم ملغ / مل إلى مركز للجرف وإضافة إلى ذلك 2 ميكرولتر من محلول الخزان.
- الوجه تغطية الشريحة بلطف وأضعها على الحلقة الشحوم على رأس البئر. اضغط لأسفل برفق حتى أن الهواء لا يمكن الخروج من البئر خلال الشق في الشحوم في العلاقات العامةحدث تراكم الضغط الجوي في البئر والحفاظ على مختوم بشكل جيد. يمكن الضغط الجوي تراكم في البئر رفع غطاء الشريحة ، المساس ختم جيدا. في أسلوب إسقاط الجلوس ، ويتم استخدام الشريط الشفاف واضح بصريا لتغطية الآبار. وبالتالي ، سيكون في هذا الختم الأسلوب تجري كل صف / عمود.
- الانتقال إلى البئر المقبل حتى علبة كاملة.
- التحقق من درج على الإعداد -- القضاء على جزيئات الغبار والملوثات الأخرى يمكن أن تقلل من هوية مزورة إيجابية من بلورات البروتين.
- استخدام ورقة التسجيل للوثيقة تجربتك.
- مكان الدرج عند درجة حرارة الحضانة المطلوب ، عموما ما بين 4 درجات حرارة مئوية وغرفة درجة. 20 درجة مئوية هو أنجح شائع. الحرص على التعامل مع علبة بلطف وتجنب أي اهتزاز. كن حذرا أثناء فتح وإغلاق الباب الحاضنة. يمكن الاهتزازات أو التغيرات في درجات الحرارة أثناء النقل أو الحضانة منع نمو البلورات أو تؤثر سلبا على نوعية الكريستال. ويمكن استخدام مواد لامتصاص الصدمات (مثل رغوة التعبئة) والحشو تحت الأدراج الكريستال.
- التحقق من علبة للبلورات في اليوم التالي ، ومن ثم كل بضعة أيام ، والمناولة دائما الأدراج مع الرعاية. أي وثيقة النتائج وmorphologies انخفاض في التهديف ورقة علبة معينة. البلورات تأخذ عادة 2-5 أيام لتظهر ، على الرغم من بلورات تظهر أحيانا في وقت أقرب بكثير (على الفور تقريبا) أو في وقت لاحق (تصل إلى عدة أشهر!). مرة واحدة وقد تم تحديد شروط التبلور وكما هو معروف أن معدل نمو البلورات ، فمن الأفضل أن تترك دون عائق الأدراج حتى بلورات ظهرت ونمت على الأقل لنصف حجمها النهائي. يمكن ترك الأدراج دون عائق خفض عدد الأحداث التنوي الكريستال ، وبالتالي إنتاج أعداد أقل من أكبر البلورات.
2. Microbatch الداخلي :
- توصف بأنها نموذج البروتين وإعداد مرسب أعلاه.
- رذاذ الهواء microbatch صينية جديدة لتجنب الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى.
- في علبة microbatch ، وملء زيت البرافين تصل إلى 3 مم (ما يكفي لتغطية الآبار). إزالة الوصول للنفط.
- تحميل 1 ميكرولتر من محلول البروتين (50 ملغ / مل الليزوزيم) في مرحلة ما قبل النفط مملوءة جيدا -- تأكد من ماصة الحل مباشرة إلى قاع البئر (الشكل 2A).
- تحميل 1 ميكرولتر من محلول مرسب في فقا جيدا إلى علبة مخطط الإعداد (الشكل 2B) -- تأكد هبوط المصارف إلى قاع البئر والصمامات مع قطيرة البروتين.
- الانتقال إلى البئر المقبل حتى علبة كاملة.
- اتبع الخطوات من 11-14 من الشنق / يجلس الإجراء الهبوط.
3. ممثل النتائج :
ويشار عادة إلى بلورة مثل عنق الزجاجة من البلورات بالأشعة السينية. مصفوفة كاملة متفرق الشاشة مضروب ظروف عجل تنتج عادة من أنواع مختلفة من تجميع البروتين وهطول الأمطار ، من بينها بلورات واحدة كبيرة. إذا كان البروتين أو مرسب تركيزات مرتفعة للغاية ويمكن للمرء أن يرى المسألة البني مع أي شكل مميز وحجم (التساقط غير متبلور). عند التشبع الحل ، فإن الهبوط غالبا ما تكون واضحة تماما وخالية من أي نوع لهطول الأمطار. ويبين الشكل 3 أمثلة عديدة لهطول الأمطار والظواهر بلورات (ديساو وآخرون ، 2006). ويمكن الاطلاع على مزيد من ظواهر هطول الأمطار مع تفسير أكثر تفصيلا في http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .
الشكل 1. مبدأ بلورة البروتين.
مبدأ بلورة البروتين. في تجربة نشر البخار (أ) وحدات التخزين على قدم المساواة مرسب والبروتينات موجودة في الانخفاض. ومنتشر خارج المياه ، وسيتم مضاعفة كل من الرواسب وتركيز البروتين حتى يتم تحقيق التوازن بين الدراسة والحل الخزان. في التبلور الدفعي (B) ومرسب وتركيز البروتين لا تتغير أثناء التجربة. بدأت بلورات البروتين التنوي يحدث ، لتشكيل وتركيز البروتين في حل قطرات من التشبع -- النقطة أ -- إقامة التشبع البروتين يمكن أن تتكون بلورات أي وباء نقطة. نقطة C -- بروتين رواسب ، ولكن قد البلورات ما زالت تنمو ، توصيل هلام (C) بلورة غسيل الكلى باستخدام الشعرية. بلورات الملح تظهر كما ينشر من العينة البروتين (و / أو ينشر مرسب في عينة بروتين) عبر المكونات هلام.
الشكل 2. مخطط نموذجي التجارب بلورة البروتين.
(أ) إجراءات لتعليق نشر انخفاض بخار ، ويجلس انخفاض بخار نشرها ، وتبلور microbatch البروتين. في كل حالة ، يتم خلط كمية صغيرة من البروتين عينة مركزة مع حجم مساو أو أصغر من precipitanر حل وسمح للتوازن. (B) لبلورة الليزوزيم الدجاج ، علبة 24 جيد تم إعداده مع تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم (لمرسب) وخلات الصوديوم بنسبة 0.1 M باعتبارها منطقة عازلة في مختلف PHS (4،0-4،9).
الشكل 3. نتائج نموذجية من البروتين تجربة التبلور.
(أ) التساقط غير متبلور. عندما البروتين أو مرسب (أو كليهما) في تركيز عال. (ب) فصل المرحلة. قد البروتين أو المنظفات منفصلة لمرحلة مختلفة عند مزجه مع precipitants معينة في تركيز عال. (C) على شكل بلورات البروتين رود AtCSN7 من الحصول عليها في 8000 والبولي ايثيلين جلايكول المغنيسيوم خلات (ديساو وآخرون ، 2006). (D) بلورات الليزوزيم في الحصول على 1،0 M كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم الهيدروجيني 4.9. (ه) تحت قطرات مشبعة تبقى عادة واضحة. التصوير الفوتوغرافي من قبل موشيه ديساو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن في هذه المقالة وصف وشرح البروتوكولات العام الجاري لبلورة البروتين. منذ أن الإجراء متعددة خطوة هناك بعض الاعتبارات يحتاج المرء أن يكون على علم. عند العمل مع كميات صغيرة جدا (0،5-2 ميكرولتر) ، والتجفيف للانخفاض بسبب التبخر هو مصدر قلق كبير. وبالتالي ، فمن المستحسن للعمل في بيئة جيدة للرقابة (مع انخفاض تدفق الهواء والرطوبة العالية وضيق تحكم بدرجة الحرارة) واعتماد الاسلوب الذي يقلل من التعرض للانخفاض في الهواء الطلق. لهذا السبب ، فمن الضروري أن تعمل في بيئة عمل جيدة التنظيم. وينبغي إعداد كل الكواشف قبل اقامة الدرج ومعدات المختبرات وينبغي أن يسهل الوصول إليها (pipetors ، نصائح ، أنابيب ، مناديل ، الخ).
كقاعدة عامة ، واتخاذ البروتين الخاص من التخزين في أقرب وقت ممكن إلى الوقت الذي سيتم وضع الدرج. بهذه الطريقة ، وهناك عدد أقل من التأثيرات البيئية على عينتك. من المهم جدا لعقد أنبوب البروتين من رقبته من الأنبوب ، وليس في القاع حيث البروتين ، لذلك لن تحصل على تسخين العينة من درجة حرارة الجسم. مع اتخاذ الاحتياطات المذكورة أعلاه ، لا يمكن التقليل من هامش للخطأ التجريبي ، وبالتالي زيادة استنساخ النتائج.
هناك العديد من التعديلات الممكنة للبروتوكولات الموصوفة هنا. يمكن للمرء أن يغير تركيز البروتين ، والبروتين / نسبة الرواسب ، ودرجة الحرارة (4 درجات مئوية -- 37 درجة مئوية) ، يمكن إضافة الرقم الهيدروجيني والمواد المضافة المختلفة. طريقة أخرى شائعة نسبيا تستخدم لبلورة البروتين هو غسيل الكلى. في هذا الأسلوب ، هو الحل مدال ضد بروتين حل مرسب عبر غشاء شبه منفذ. محاكمات غسيل الكلى هي أكثر تعقيدا لإعداد ، ولكن ميزة واحدة للغسيل والتي يمكن بسهولة ظروف الامطار وانخفاض القوة الأيونية يتم اختبارها. هذا أمر مرغوب فيه إذا كان بروتين قابل للذوبان الملح سيئة عند تركيزات منخفضة ، ومنذ ذلك الحين البروتين قد تتبلور كما هو مدال الملح بعيدا عن العازلة البروتين. ويمكن استخدام المرحلة الصلبة (جل) للسيطرة على معدل غسيل الكلى. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الجل agarose داخل الشعري كواجهة نشرها بين البروتين والحلول مرسب (الشكل 1C).
ويمكن زيادة تركيز عامل عجل الى نقطة التشبع ، وأقل بقليل ثم تعديل درجة الحموضة أو درجة الحرارة للحد من القابلية للذوبان من البروتين يمكن استخدامها لبلورة العينات مع تركيز منخفض البروتين. ويمكن تحقيق تعديل درجة الحموضة بشكل جيد للغاية مع انتشار تقنية البخار ، عندما تستخدم الأحماض المتطايرة والقواعد مثل حمض الخليك ، وهيدروكسيد الأمونيوم أو أسيتات الأمونيوم (ماكفرسون ، 2004).
ويمكن في هذه التقنية دفعة صغيرة يمكن اختبار مجموعة كاملة من خلائط النفط لتغطية الآبار. الزيوت المختلفة permeabilities التبخر مختلفة ، وبالتالي تنتج معدلات مختلفة من التغيرات تركيز خليط من البروتين / مرسب في إطار برنامج النفط.
بلورة خطوة المطلوبة للحصول على المعلومات الهيكلية الجزيئات الذرية في شبه القرار. الأساليب المذكورة هنا هي بالتالي أساسية لدراسة الآليات وانزيم البروتين البروتين أو البروتينات والأحماض النووية التفاعلات ، ونحن في نهاية المطاف واحدة من أهم الأدوات في الهيكل القائم على المخدرات تصميم والتطوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المحقق بوروز ويلكوم لجائزة YM وزمالة براون Coxe بعد الدكتوراة من جامعة ييل لMD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | |
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | |
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. Crystallization of biological macromolecules. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
