Summary
De 3-D structuur van een molecuul zorgt voor een uniek inzicht in hoe het molecuul functies. De belangrijkste methode voor de bepaling van de structuur bijna-atomaire resolutie is X-ray kristallografie. Hier tonen we de huidige methoden voor het verkrijgen van drie-dimensionale kristallen van een bepaalde macromolecuul die geschikt zijn voor de structuur bepaling door X-ray kristallografie.
Abstract
Met behulp van de driedimensionale structuur van biologische macromoleculen af te leiden hoe ze werken is een van de meest belangrijke gebieden van de moderne biologie. De beschikbaarheid van atomaire resolutie structuren zorgt voor een diepe en unieke kennis van proteïne functie, en helpt bij het ontrafelen van de interne werking van de levende cel. Tot op heden 86% van de Protein Data Bank (rcsb-PDB) inzendingen zijn macromoleculaire structuren die werden bepaald met behulp van X-ray kristallografie.
Voor het verkrijgen van kristallen die geschikt zijn voor kristallografische studies, het macromolecuul (bijv. eiwitten, nucleïnezuur, eiwit-eiwit complex of eiwit-nucleïnezuur complex) moet worden gezuiverd tot de homogeniteit, of zo dicht mogelijk bij de homogeniteit. De homogeniteit van het preparaat is een belangrijke factor bij het verkrijgen van kristallen die breken op een hoge resolutie (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Kristallisatie vereist waardoor het macromolecuul naar oververzadiging. Het monster dient derhalve te worden geconcentreerd om de hoogst mogelijke concentratie, zonder dat aggregatie of precipitatie van het macromolecuul (meestal 2-50 mg / ml). De invoering van het monster tot neerslagmiddel kan bevorderen de nucleatie van eiwitkristallen in de oplossing, wat kan leiden tot grote drie-dimensionale kristallen groeien van de oplossing. Er zijn twee belangrijke technieken om kristallen te verkrijgen: dampdiffusie en batch-kristallisatie. In dampdiffusie, een druppel die een mengsel van neerslag en eiwit-oplossingen is verzegeld in een kamer met pure neerslagmiddel. Waterdamp diffundeert vervolgens uit van de daling tot aan de osmolariteit van de druppel en de neerslag zijn gelijk (Figuur 1A). De uitdroging van de daling veroorzaakt een langzame concentratie van zowel eiwit en neerslagmiddelen totdat evenwicht is bereikt, idealiter in het kristalnucleatie zone van het fasediagram. De batch methode berust op het brengen van het eiwit direct in de nucleatie-zone door het mengen van eiwit met de juiste hoeveelheid neerslag (Figuur 1B). Deze methode wordt meestal uitgevoerd onder een paraffine / minerale olie mengsel aan de diffusie van water te voorkomen uit de druppel.
Hier zullen we laten twee soorten experimentele setup voor dampdiffusie, opknoping te laten vallen en zitten druppel, naast de batch kristallisatie onder olie.
Protocol
Materialen:
- Eiwitmonster - lysozym (50 mg / ml)
- Opknoping druppel 24-well tray
- Zittend druppel 24-well tray
- Microbatch kristallisatie 96 goed tray
- Kristallisatie-oplossingen (hetzij commercieel beschikbaar of zelfgemaakte)
- Siliconenvet
- 5 ml injectiespuit zonder Luer-lock
- Gesiliconiseerde deksel dia's
- Optische afdichtband
- Paraffine
- 0,1-2 pi micropipet met een lage retentie-tips
- Pincet
- Professionele doekjes
1. Opknoping / zittend Drop Procedure:
- Voor een eerste scherm kan men in de handel verkrijgbare schermen die de schaarse matrix onvolledige factorieel wijze van proef aan te grijpen. De spaarzame matrix onvolledig factoriële methode is bevooroordeeld door en gekozen worden uit bekende kristallisatie voorwaarden voor macromoleculen (Carter en Carter, 1979; Cudney et al., 1994;. Jancarik en Kim, 1991;. Jancarik et al., 1991). Als de kristallisatie aandoening is al bekend is, kan een smal scherm worden gemonteerd, het variëren van de neerslag concentratie en pH-waarde rond de oorspronkelijke hit. De meest succesvolle neerslagmiddelen is polyethyleenglycol (PEG), gevolgd door ammoniumsulfaat. Samen vormen deze twee neerslagmiddelen goed voor ongeveer 60% van alle geregistreerde macromoleculaire neerslagmiddelen die worden gebruikt voor kristallisatie (Gilliland et al., 1994;. Kimber et al., 2003;.. Page et al., 2003).
- Bereid je kristallisatie-oplossingen. Meestal deze voorwaarden worden gecombineerd uit een neerslagmiddel, zout of iets dergelijks en een buffer om de pH in te stellen. In sommige gevallen additieven kunnen specifiek worden toegevoegd voor het eiwit van belang. Alle stockoplossing moet worden gefilterd met behulp van 0,22 urn filter. Een deel van de voorraad oplossing zou kunnen zijn zeer viskeus (50% PEG, glycerol, PEG-MME, etc).
- Bereid 1,5 ml van 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M NaCl elk in 0,1 M NaOAc pH 4,0, 4,3, 4,6 en 4,9 (totaal 24 oplossingen)
- Ontdooi je eiwitmonster en blijf op ijs. Eiwit voorraden moeten worden opgeslagen bij -80 ° C, tenzij het eiwit van belang is gevoelig voor vries / dooi cycli (zo ja, op te slaan bij 4 ° C). Typische eiwitten concentraties in de range van 5-50 mg / ml, met hogere concentraties meestal het geven van betere resultaten.
- Spin van het monster 15min/18, 000xg / 4 ° C - sommige eiwitten hebben de neiging om gedeeltelijk aggregaat en neerslag na een dooi stap. Deze aggregaten kunnen bevorderen amorf neerslag van de rest van de eiwitmoleculen dan ook een grondige spin down zorgt ervoor dat u alleen oplosbare moleculen in je steekproef. Houden eiwit op ijs totdat het opzetten van de lade.
- Bepaal de proteïne concentratie van de absorptie bij 280 nm met behulp van een UV-spectrofotometer. Het eiwit-concentratie kan worden berekend uit de absorptie te lezen en het eiwit van de extinctiecoëfficiënt. De extinctiecoëfficiënt kan worden berekend met de ProtParam tool op de website Expasy: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- Vul putjes van de 24-well opknoping / zitten druppel tray met 500 pl van neerslagmiddelen oplossing volgens de lade-instellingen regeling (figuur 2B). Maak een siliconenvet ring rond de rand van de put. De ring moet een kleine opening om lucht drukopbouw te voorkomen als het goed is afgedicht. In zit daalt, is er geen behoefte aan vet, omdat het goed is afgedicht met tape (Figuur 2A).
- Neem een deksel glijden en reinig deze met gecondenseerde lucht spray, of een professionele veeg - het vermijden van stof zal de interpretatie van de kristallisatie neerzetten en elimineren van besmettingen. Om te zitten druppels, zijn deksel schuift niet gebruikt. In plaats daarvan, de put bevat een rek waarop het eiwit en neerslag worden gemengd.
- Doe gelijke hoeveelheden van het eiwit monster en het reservoir oplossing op de cover dia. Verschillende volumes van eiwit en neerslagmiddelen kunnen worden berecht als onderdeel van de optimalisatie proces. Met behulp van meer eiwitten dan neerslagmiddelen resulteert in een netto concentratie van het eiwit in het drop bij evenwicht, dat kan wenselijk zijn voor verdunde eiwit monsters, en om kristalnucleatie of groei traag. Elke andere niet-vluchtig stof in de drop-oplossing zal ook worden geconcentreerd door dezelfde factor. Wanneer pipetteren het eiwit en het reservoir oplossingen op het deksel glijden, uiterst voorzichtig te borrelen vorming te voorkomen. Dit gebeurt vaak wanneer lucht wordt geblazen uit de pipet.
- Opknoping druppel: Load 2 pi van 50 mg / ml lysozym in 0,02 M NaOAc pH 4,9 tot het midden van het deksel glijden en aan te vullen 2 pi van het reservoir oplossing.
- Zittend druppel: Load 2 pi van 50 mg / ml lysozym-oplossing naar het midden van de plank en aan toe te voegen 2 pl van het reservoir oplossing.
- Voorzichtig til de klep schuift en leg hem neer op het vet ring op de top van de put. Druk voorzichtig zodat de lucht kan uit de put te ontsnappen door de uitsparing in het vet te prIndien de luchtdruk in de opbouw goed en houd de goed afgesloten. Lucht drukopbouw in de put kan verhogen het deksel glijden, koste gaat van de goed afdichting. In de zitting neerzetten, is optisch helder transparante tape gebruikt om de putten te dekken. Daarom zal in deze methode afdichten plaats elke rij / kolom.
- Ga verder naar de volgende goed tot tray is voltooid.
- Controleer de lade bij setup - het elimineren van stofdeeltjes en andere verontreinigingen kunnen de valse positieve identificatie van eiwitkristallen te verminderen.
- Gebruik een scoreblad om uw experiment document.
- Plaats de lade op de gewenste temperatuur incubatie, in het algemeen tussen de 4 ° C en kamertemperatuur. 20 ° C is het meest succesvol. Zorg ervoor dat de lade voorzichtig behandelen en eventuele schudden te voorkomen. Wees voorzichtig bij het openen en sluiten van de incubator deur. Trillingen of temperatuur verandert tijdens de overdracht of incubatie kan voorkomen kristalgroei of negatief beïnvloeden kristal kwaliteit. Een schok absorberend materiaal (bv verpakking schuim) kan gebruikt worden als opvulling in het kristal laden.
- Controleer of de lade voor kristallen de volgende dag, en vervolgens om de paar dagen, altijd de behandeling van de trays met zorg. Document eventuele bevindingen en drop morfologie in een lade specifieke scoreblad. Kristallen nemen meestal 2-5 dagen te verschijnen, hoewel kristallen zo nu en dan verschijnen veel sneller (vrijwel direct) of later (tot enkele maanden!). Zodra kristallisatie voorwaarden zijn geïdentificeerd en de groei van de kristallen bekend is, is het het beste om te vertrekken van de trays ongestoord tot er kristallen zijn verschenen en uitgegroeid tot minstens de helft van hun uiteindelijke grootte. Het verlaten van de trays ongestoord kan verminderen van het aantal kristalnucleatie evenementen, dus het produceren van kleinere aantallen van grotere kristallen.
2. Microbatch Procedure:
- Eiwitmonster en neerslagmiddelen bereiding zijn zoals hierboven beschreven.
- Lucht spuit een nieuw microbatch lade stof en andere grote deeltjes te voorkomen.
- In de microbatch lade, vul paraffine olie tot 3 mm hoog (net genoeg om de bronnen te dekken). Verwijder de toegang van olie.
- Belasting 1 ul van eiwit-oplossing (50 mg / ml lysozym) in de olie-voorgevulde goed - zorg ervoor dat de oplossing direct pipet naar de bodem van de put (Figuur 2A).
- Belasting een pi van flocculant oplossing in de put volgens het lade-instellingen regeling (figuur 2B) - zorg ervoor dat de daling zinkt naar de bodem van de put en zekeringen met het eiwit druppel.
- Ga naar de volgende goed tot tray is voltooid.
- Volg de stappen 11-14 van de opknoping / zitten druppel procedure.
3. Representatieve resultaten:
Kristallisatie wordt meestal aangeduid als het knelpunt van de X-ray kristallografie. Een sparse matrix onvolledig faculteit scherm van precipiterende voorwaarden produceert meestal veel verschillende soorten eiwit aggregatie en neerslag, waaronder grote single kristallen. Als het eiwit of neerslag concentraties te hoog zijn kan men zien bruin kwestie zonder duidelijke vorm en grootte (amorf neerslag). Wanneer de oplossing is onderverzadigd, zal de druppel vaak volkomen helder zijn en verstoken van elke vorm van neerslag. Figuur 3 toont verschillende voorbeelden voor het neerslaan fenomenen en kristallen (Dessau et al., 2006).. Meer neerslag verschijnselen met meer gedetailleerde uitleg is te vinden op http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .
Figuur 1. Het principe van proteïne kristallisatie.
Het principe van proteïne kristallisatie. In een damp diffusie experiment (A) gelijke volumes van de neerslag en eiwit aanwezig zijn in de drop. Het water zal diffuus uit en zowel de neerslag en de eiwitconcentratie zal worden verdubbeld tot evenwicht wordt bereikt tussen de daling en het reservoir oplossing. In batch kristallisatie (B) de neerslag en de eiwitconcentratie niet veranderen tijdens het experiment. Punt A - Protein blijft onderverzadigd geen kristallen gevormd kunnen worden, punt B - Protein nucleatie optreden, kristallen begon te vormen en de concentratie van eiwitten in oplossing daalt tot verzadiging. Punt C - Eiwit neerslaat, maar kristallen kunnen nog steeds groeien. (C) Dialyse kristallisatie met behulp van een gel-aangesloten capillaire. Kristallen verschijnen als zout diffundeert uit het eiwit monster (en / of flocculant diffundeert in het eiwit monster) over de gel stekker.
Figuur 2. Overzicht van de typische proteïne kristallisatie experimenten.
(A) Procedures voor opknoping druppel dampdiffusie, zittend druppel dampdiffusie, en microbatch proteïne kristallisatie. In elk geval, is een klein volume van geconcentreerde eiwit monster, gemengd met een gelijk of kleiner volume van precipitant-oplossing en liet in evenwicht. (B) Voor de kristallisatie van kip lysozym, een 24-wells lade is opgezet met verschillende concentraties natriumchloride (de neerslag) en met 0,1 M natriumacetaat als de buffer bij verschillende pH (4.0-4.9).
Figuur 3. Typische resultaten van een proteïne kristallisatie experiment.
(A) Amorfe neerslag. Bij het eiwit of neerslagmiddelen (of beide) zijn in hoge concentratie. (B) Fase scheiding. Eiwit of reinigingsmiddel kan scheiden om een andere fase bij menging met bepaalde neerslagmiddelen bij hoge concentratie. (C) Rod vormige eiwitten kristallen van AtCSN7 verkregen in polyethyleenglycol 8000 en magnesium-acetaat (Dessau et al., 2006).. (D) Lysozym kristallen verkregen in 1,0 M NaCl en natriumacetaat pH 4,9. (E) Onder verzadigde daalt meestal helder blijven. Fotografie door Moshe Dessau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel beschrijven we en demonstreren het algemeen de huidige protocollen voor proteïne kristallisatie. Omdat het een multi-step procedure er zijn maar weinig overwegingen moet men zich bewust zijn van. Bij het werken met zeer kleine hoeveelheden (0,5-2 pi), drogen van de daling als gevolg van verdamping is een grote zorg. Daarom is het raadzaam om te werken in een goed gecontroleerde omgeving (met een lage lucht-flow, hoge luchtvochtigheid en strakke temperatuur controle) en een techniek die minimaliseert blootstelling van de daling in de open lucht te nemen. Om deze reden is het essentieel om te werken in een goed georganiseerde werkomgeving. Alle reagentia moeten voorafgaand bereid zijn om het opzetten van de lade en lab-apparatuur moet binnen handbereik (pipetors, tips, buizen, doekjes, enz.).
Als algemene regel, neem je eiwit uit de opslag zo dicht mogelijk bij de tijd zult u het opzetten van de lade. Op die manier zijn er minder milieu-invloeden op uw monster. Het is zeer belangrijk om het eiwit buis te houden door de hals van de buis en niet op de bodem, waar het eiwit is, zodat de steekproef zal niet verwarmd van uw lichaamstemperatuur. Met de bovenstaande voorzorgsmaatregelen, kan de experimentele marge van fouten tot een minimum beperkt, waardoor de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Er zijn veel mogelijke wijzigingen van de protocollen hier beschreven. Men kan veranderen eiwitconcentratie, eiwit / neerslagmiddelen verhouding, temperatuur (4 ° C - 37 ° C), pH en diverse additieven kunnen worden toegevoegd. Een ander relatief veel gebruikte methode voor eiwit kristallisatie is dialyse. In deze methode wordt het eiwit oplossing gedialyseerd tegen een neerslag oplossing via een semi-permeabel membraan. Dialyse studies zijn meer lastig in te stellen, maar een voordeel van de dialyse is dat de neerslag omstandigheden van lage ionische sterkte gemakkelijk kan worden getest. Dit is wenselijk als het eiwit is slecht oplosbaar bij lage zoutconcentraties, omdat het eiwit dan kan kristalliseren als het zout uit de buurt van het eiwit buffer gedialyseerd. Een vaste fase (gel) kan worden gebruikt om de snelheid van de dialyse controle. Zo kan bijvoorbeeld een agarosegel in een capillair worden gebruikt als de diffusie interface tussen het eiwit en de neerslag oplossingen (figuur 1C).
Het verhogen van de concentratie van een neerslagmiddel naar een punt net onder de oververzadiging en vervolgens het aanpassen van de pH of temperatuur om de oplosbaarheid van het eiwit te verminderen kan worden gebruikt om monsters te kristalliseren met een laag eiwit-concentratie. Wijziging van de pH kan heel goed worden bereikt met de dampdiffusie techniek, wanneer vluchtige zuren en basen, zoals azijnzuur, ammonium hydroxide of ammoniumacetaat worden gebruikt (McPherson, 2004).
In de micro-batch techniek een hele reeks van mengsels van olie kan worden getest om de putten te dekken. Verschillende oliën hebben verschillende verdamping permeabiliteit, en dus produceren verschillende tarieven van concentratie veranderingen van het eiwit / flocculant mengsel onder de olie.
Kristallisatie is een vereiste stap voor het verkrijgen van structurele informatie van macromoleculen in de buurt-atomaire resolutie. De hier beschreven methoden zijn daarom van fundamenteel belang voor het bestuderen van enzym mechanismen en eiwit-eiwit of eiwit-nucleïnezuur interacties, en zijn uiteindelijk een van de belangrijkste instrumenten in de structure-based drug design en ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Burroughs Wellcome Investigator Award voor YM en door een Brown-Coxe Postdoctoral Fellowship van de Yale University tot MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | |
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | |
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. Crystallization of biological macromolecules. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
