Summary
3-D структура молекулы дает уникальное понимание того, как функции молекулы. Основным методом определения структуры в ближнем атомное разрешение рентгеновской кристаллографии. Здесь мы демонстрируем, современные методы получения трехмерных кристаллов любой макромолекулы, которые подходят для определения структуры методом рентгеновской кристаллографии.
Abstract
Использование трехмерной структуры биологических макромолекул сделать вывод, как они функционируют является одним из важнейших направлений современной биологии. Наличие атомных структур разрешение обеспечивает глубокое и уникальное понимание функции белка, и помогает раскрыть внутренние механизмы живой клетки. На сегодняшний день 86% Protein Data Bank (rcsb-PDB) записи макромолекулярных структур, которые были определены с помощью рентгеновской кристаллографии.
Для получения кристаллов подходит для кристаллографических исследований, макромолекулы (например, белки, нуклеиновые кислоты, белок-белкового комплекса или белково-нуклеиновых кислот комплекса) должны быть очищены до гомогенного состояния, или как можно ближе к однородности. Однородности подготовки является ключевым фактором в получении кристаллы, которые преломляют с высоким разрешением (Bergfors, 1999; Макферсон, 1999).
Кристаллизация требует приведения макромолекулы пересыщения. Выборка должна быть сосредоточена в максимально возможной концентрации, не вызывая агрегации или осаждения макромолекулы (обычно 2-50 мг / мл). Введение образца осадителя может способствовать зарождению кристаллов белка в решение, которое может привести к большим трехмерным выращивания кристаллов из раствора. Есть два основных метода получения кристаллов: диффузии пара и пакетного кристаллизации. В диффузии водяного пара, капли, содержащие смесь осадителя и белковых растворов запечатывается в камере с чистой осадителя. Водяной пар затем диффундирует из падают осмолярность падение и осадителя равны (рис. 1А). Обезвоживания падение причины медленного концентрации белка и осадителя, пока равновесие достигается, в идеале в кристалле зоне зарождения фазовой диаграммы. Партия метод основан на ввоз белок непосредственно в зоне зарождения, смешивая белки с соответствующим количеством осадителя (рис. 1В). Этот метод обычно проводится под парафином / смесь минерального масла, чтобы предотвратить распространение воды из капли.
Здесь мы покажем два вида экспериментальной установки для диффузии пара, висячей капли и, сидя капли, в дополнение к партии кристаллизации в масле.
Protocol
Материалы по теме:
- Белки образца - лизоцима (50 мг / мл)
- Висячие падение 24-а лоток
- Сидя падение 24-а лоток
- Microbatch кристаллизации 96 и лоток
- Кристаллизация решений (как коммерческих, в наличии или домашний)
- Силиконовая смазка
- 5 мл шприц без Луер-Лок
- Силиконизированный слайды крышкой
- Оптический уплотнительная лента
- Парафин
- 0.1-2 мкл микропипетки с низким уровнем удержания советы
- Пинцет
- Профессиональные салфетки
1. Висячие / сидя удалить процедуру:
- Для начального экрана можно использовать коммерчески доступные экраны, которые эксплуатируют разреженной матрицы неполной факториал методом проб условиях. Разреженной матрицы неполной факториал метод искаженных и выбраны из известных условий кристаллизации для макромолекул (Картер и Картер, 1979; Cudney и др., 1994;. Jancarik и Ким, 1991;. Jancarik и др., 1991). Если кристаллизация условие уже известно, узкий экран может быть собрана, варьируя осадителя концентрации и рН вокруг оригинального хита. Наиболее часто успешным осадителя полиэтиленгликоля (ПЭГ), затем следуют сульфат аммония. Вместе эти два осадителей приходится примерно 60% всех зарегистрированных макромолекулярных осадителей использован для кристаллизации (Гиллилэнд и др., 1994;. Кимбер и др., 2003;.. Страницу и др., 2003).
- Подготовка решения кристаллизации. Как правило, эти условия сочетаются с осадителя, соль какого-то и буфер для установки рН. В некоторых случаях добавки могут быть добавлены специально для белок. Все акции решения должны быть отфильтрованы с помощью 0,22 мкм фильтр. Некоторые из маточного раствора может быть очень вязкой (50% ПЭГ, глицерин, ПЭГ-MME, и т.д.).
- Подготовка 1,5 мл 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 М NaCl каждый в 0,1 М NaOAc рН 4,0, 4,3, 4,6 и 4,9 (в общей сложности 24 решений)
- Оттепель вашего белка образца и держать на льду. Белки запасы должны храниться при температуре -80 ° С, если белок чувствителен к циклов замораживания / оттаивания (если да, то хранить при 4 ° С). Типичные концентрации белка в диапазоне 5-50 мг / мл, с более высокой концентрацией обычно дает лучшие результаты.
- Спиновые образец 15min/18, 000xg / 4 ° C - некоторые белки, как правило, частично совокупности и осадок после оттепели шаг. Эти агрегаты могут способствовать аморфное осаждение остальных белковых молекул, поэтому тщательный спином вниз обеспечит вас есть только растворимые молекулы в вашей выборке. Держите белка на льду до создания лоток.
- Определение концентрации белка от его поглощению при 280 нм с использованием УФ-спектрофотометр. Концентрация белка может быть вычислена по измерять оптическую плотность и коэффициент экстинкции белка. Коэффициент экстинкции может быть рассчитана с помощью инструмента ProtParam на Expasy сайте: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- Заполните скважин 24-а висит / сидя падение поднос с 500 мкл осадителя решение по схеме лоток установки (рис. 2В). Создать кольцо силиконовой смазки вокруг края хорошо. Кольцо должно иметь небольшой зазор, чтобы предотвратить наращивание давления воздуха, как хорошо запечатан. В сидя капли, нет необходимости для смазки с хорошо запечатана с лентой (рис. 2А).
- Возьмите крышку слайд и очистите его со сгущенным воздухом спрей, или профессионального стереть - попадания в него пыли облегчит интерпретацию кристаллизации снижение и устранение загрязнения. Для сидя капель, крышка слайд не используются. Вместо этого, также содержит полка, на которой белка и осадителя носят смешанный характер.
- Положите равные объемы образца белка и водохранилища решение на обложке слайда. Различные объемы белка и осадителя может быть осужден как часть процесса оптимизации. Использование большего количества белка, чем осадителя приводит к чистой концентрации белка в падение после равновесия, которое может быть желательным для разбавленных образцов белков, и, чтобы замедлить зарождения кристалла или рост. Любые другие нелетучих веществ в капле решение также будет сосредоточено столько же раз. Когда пипетирования белка и резервуар решения на крышку слайд, будьте очень осторожны, чтобы избежать образования пузырьков. Это часто происходит, когда воздух выдувается из пипетки.
- Висячей капли: Load 2 мкл 50 мг / мл лизоцима в 0,02 М NaOAc рН 4,9 до центре крышки слайд и добавить к нему 2 мкл водохранилище решение.
- Сидя капли: Load 2 мкл 50 мг / мл лизоцима решение центре шельфа и добавить к нему 2 мкл водохранилище решение.
- Переверните крышку слайд мягко и отдать ее на смазку кольцо на верхней части колодца. Пресс мягко так, чтобы воздух мог выйти из скважины через выемку в смазку пр.событие давления воздуха наращивание хорошо и держать плотно закрытой. Давление воздуха в наращивание также может поднять крышку слайд, ущерба и печатью. В заседании капельным методом, оптически прозрачный лента используется для покрытия скважин. Следовательно, в этом методе уплотнения будут проводиться раз в строку / столбец.
- Переходите к следующему хорошо, пока лоток завершена.
- Проверьте лоток на установку - устранение частиц пыли и других загрязнений может уменьшить ложное срабатывание идентификации белковых кристаллов.
- Используйте забил лист документировать эксперимент.
- Место лоток на нужной температуры инкубации, как правило, от 4 до температуры ° С и комнаты. 20 ° С чаще всего успешно. Позаботьтесь, чтобы обрабатывать лоток мягко и избежать тряски. Будьте осторожны при открытии и закрытии двери инкубатора. Вибрации или изменения температуры во время передачи или инкубации может предотвратить рост кристаллов или отрицательно влияют на качество кристалла. Амортизирующие материалы (например, пенопласт упаковка) может быть использована в качестве набивки под кристалл лотков.
- Проверьте лоток для кристаллов на следующий день, а затем каждые несколько дней, всегда обработки лотков с осторожностью. Документ каких-либо выводов и падение морфологии в лоток конкретный лист скоринга. Кристаллы обычно занимает 2-5 дней появляются, хотя кристаллы иногда появляются гораздо раньше (почти сразу) или выше (до нескольких месяцев!). Как только условия кристаллизации были выявлены и темпы роста кристаллов, как известно, лучше всего оставить лотки спокойно, пока кристаллы появились и выросли, по крайней мере половину своих окончательных размеров. Оставив лотки спокойно можете уменьшить количество кристаллических зародышей событий, что ведет к меньшим числом более крупных кристаллов.
2. Microbatch процедуры:
- Образце белка и осадителя препарата, как описано выше.
- Пневматическое распыление новый лоток microbatch, чтобы избежать пыли и других крупных частиц.
- В microbatch лоток, заполните парафинового масла до 3 мм (как раз достаточно, чтобы покрыть скважин). Удалить доступ на нефть.
- Нагрузка 1 мкл раствора белка (50 мг / мл лизоцима) в масло предварительно заполненных хорошо - убедитесь, что пипетка раствор непосредственно на дне колодца (рис. 2А).
- Нагрузка 1 мкл раствора в осадок и в соответствии со схемой установки лотка (рис. 2Б) - убедитесь, что капля опускается на дно колодца и сливается с белком капли.
- Перейти к следующему хорошо, пока лоток завершена.
- Выполните шаги 11-14 из повешение / сидя падение процедуры.
3. Представитель Результаты:
Кристаллизация обычно называют узкое рентгеновской кристаллографии. Разреженной матрицы неполной факториал экране осаждения условиях обычно производит много различных типов агрегации белков и осадки, в том числе крупных монокристаллов. Если белка или осадителя концентрация слишком высока можно увидеть коричневые дело без каких-либо различных формы и размера (аморфные осадки). Когда решение недосыщены, падение часто будет вполне ясно и лишенной каких-либо осадков. На рисунке 3 показано несколько примеров для осаждения явлений и кристаллов (Дессау и соавт., 2006). Больше осадков явлений с более подробной интерпретации можно найти на http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .
Рисунок 1. Принцип кристаллизации белков.
Принцип кристаллизации белков. В эксперименте диффузии пара () равные объемы осадителя и белка присутствуют в капле. Вода будет диффузная, и как осадителя и концентрации белка будет удвоен до равновесие достигается между каплей и водохранилища решение. В пакетном кристаллизации (B) осадителя и концентрация белка не изменяются в процессе эксперимента. Точка - белка остается недосыщены кристаллов не может быть сформирована, Point B - белка происходит зарождение, кристаллы начали формироваться и концентрация белка в растворе падает до насыщения. Точка C - Белки осадков, но кристаллы могут по-прежнему расти. (C) Диализ кристаллизации использованием гель-подключен капилляр. Кристаллы появляются как соль диффундирует из белка выборки (и / или осадителя диффундирует в образце белка) через гель пробки.
Рисунок 2. План типичных экспериментов кристаллизации белков.
() Процедуры для подвешивания диффузии падение пары, сидя диффузии падение пара и кристаллизации microbatch белка. В каждом случае небольшого объема концентрированного образца белка смешивают с равным или меньшим объемом precipitanт решение и позволил, чтобы уравновесить. (B) Для кристаллизации куриного лизоцима, 24-а лоток устанавливается с различным содержанием хлорида натрия (осадок) и с 0,1 М ацетата натрия в качестве буфера при различных значениях рН (4,0 - 4,9).
Рисунок 3. Типичные результаты эксперимента кристаллизации белков.
(А) аморфные осадки. Когда белок или осадителя (или оба) находятся в высокой концентрации. (B) Разделение фаз. Белки или моющего средства могут быть разделены на различные фазы, когда смешивается с определенным осадителей при высокой концентрации. (C) Род формы кристаллов белка AtCSN7 полученные в полиэтиленгликоля 8000 и магния ацетат (Дессау и соавт., 2006). (D) Лизоцим кристаллы, полученные в 1,0 М NaCl и ацетата натрия рН 4,9. (Е) В насыщенном капель обычно остаются ясно. Фотограф Моше Дессау.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы расскажем и продемонстрировать общие текущие протоколы для кристаллизации белков. Так как это многоступенчатая процедура Есть несколько соображений, нужно быть в курсе. При работе с очень малых объемах (0,5-2 мкл), сушки капли за счет испарения является основной проблемой. Следовательно, рекомендуется для работы в хорошо контролируемых условиях (с низким потоком воздуха, высокая влажность и жесткий контроль температуры) и принять метод, который сводит к минимуму воздействие снизится до открытом воздухе. По этой причине, очень важно работать в хорошо организованной рабочей среды. Все реагенты должны быть подготовлены до создания лоток и лабораторное оборудование должно быть в пределах легкой досягаемости (pipetors, советы, трубки, салфетки и т.д.).
Как правило, возьмите белок из хранения как можно ближе ко времени вы будете настройке лотка. Таким образом, Есть меньше влияния окружающей среды на образец. Очень важно провести белка трубы шею трубки, а не на дно, где белок, так что образец не будет нагревается от температуры тела. С учетом указанных выше мер предосторожности, экспериментальные погрешности могут быть сведены к минимуму, тем самым увеличивая воспроизводимость результатов.
Есть много возможных изменений в протоколы, описанные здесь. Можно изменять концентрацию белка, белок / осадителя отношение, температуры (4 ° C - 37 ° С), рН и различные добавки могут быть добавлены. Другой относительно часто используемый метод для кристаллизации белков является диализ. В этом методе, белка решение диализу против осадителя раствора через полупроницаемую мембрану. Диализ испытания более громоздким в настройке, но одним из преимуществ является то, что диализ осадков условиях низкой ионной силы могут быть легко проверены. Это желательно, если белок плохо растворяется при низкой концентрации соли, так как белок может затем кристаллизуются в виде соли диализу от белка буфером. Твердой фазы (гель) может быть использована для контроля скорости диализа. Например, гель агарозы внутри капиллярной можно использовать в качестве интерфейса между диффузии белка и осадителя решений (рис. 1в).
Увеличение концентрации осадителя к точке чуть ниже пересыщения и затем отрегулировать рН или температуру уменьшить растворимость белка может быть использован для кристаллизации образцов с низкой концентрацией белка. Модификация рН может быть выполнена очень хорошо с техникой диффузии водяного пара, когда летучие кислоты и основания, такие как уксусная кислота, гидроксид аммония или ацетата аммония используются (McPherson, 2004).
В микро-партии технику целый ряд нефтяных смесей могут быть проверены, чтобы покрыть скважин. Различные масла имеют различную проницаемость испарения, и, следовательно, дают разные темпы изменения концентрации белка / осадителя смеси под масла.
Кристаллизация необходимого шага для получения структурной информации макромолекул в ближнем атомным разрешением. Методы, описанные здесь, таким образом, основополагающее значение для изучения механизмов и фермент белок-белковых и белок-нуклеиновых кислот взаимодействий и, в конечном счете одним из самых важных инструментов в структуре основе дизайна и разработки лекарственных средств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана следователь Burroughs Wellcome награду Ю.М. и Brown-Кокс Докторантура стипендий из Йельского университета Мэриленд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | |
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | |
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. Crystallization of biological macromolecules. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
