Summary
एक अणु के 3-D संरचना कैसे अणु कार्यों का एक अनूठा समझ प्रदान करता है. पास परमाणु संकल्प संरचना निर्धारण के लिए प्रमुख विधि एक्स - रे क्रि है. यहाँ, हम किसी भी macromolecule के तीन आयामी क्रिस्टल है कि एक्स - रे क्रि द्वारा संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त हैं प्राप्त करने के लिए मौजूदा तरीकों को प्रदर्शित करता है.
Abstract
जैविक अणुओं की तीन आयामी संरचना का उपयोग करने के लिए अनुमान है कि वे कैसे समारोह के आधुनिक जीव विज्ञान की सबसे महत्वपूर्ण क्षेत्रों में से एक है. परमाणु संकल्प संरचनाओं की उपलब्धता प्रोटीन समारोह के एक गहरी और अद्वितीय समझ प्रदान करता है, और जीवित कोशिका की अंदरूनी कामकाज को जानने में मदद करता है. तिथि करने के लिए, प्रोटीन डाटा बैंक (rcsb PDB) प्रविष्टियों के 86% macromolecular संरचनाओं कि एक्स - रे क्रि का उपयोग निर्धारित किया गया है.
Crystallographic अध्ययन के लिए उपयुक्त क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए, macromolecule (जैसे प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, प्रोटीन जटिल या प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड परिसर) एकरूपता शुद्ध होना चाहिए, या के रूप में एकरूपता के लिए करीब संभव है. तैयारी की एकरूपता क्रिस्टल है कि उच्च संकल्प के लिए टुकड़े (; McPherson, 1999, Bergfors, 1999) को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक है.
Crystallization supersaturation के लिए macromolecule लाने की आवश्यकता है. नमूना इसलिए एकत्रीकरण या macromolecule (आमतौर पर 2-50 मिलीग्राम / एमएल) की तेज़ी के कारण के बिना उच्चतम संभव एकाग्रता के लिए ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. Precipitating एजेंट नमूना परिचय समाधान है, जो बड़े तीन आयामी समाधान से बढ़ क्रिस्टल में परिणाम कर सकते हैं में प्रोटीन क्रिस्टल की nucleation को बढ़ावा कर सकते हैं. वाष्प प्रसार और बैच crystallization: वहाँ दो मुख्य तकनीकों क्रिस्टल प्राप्त कर रहे हैं. वाष्प प्रसार, एक तेज़ और प्रोटीन समाधान के एक मिश्रण युक्त ड्रॉप में शुद्ध तेज़ के साथ एक कक्ष में बंद है. जल वाष्प तो बूंद के बाहर diffuses जब तक ड्रॉप और तेज़ की osmolarity बराबर (चित्रा 1 ए) कर रहे हैं. ड्रॉप की निर्जलीकरण दोनों प्रोटीन और तेज़ की एक धीमी गति से एकाग्रता का कारण बनता है जब तक संतुलन हासिल की है चरण आरेख के क्रिस्टल nucleation के क्षेत्र में आदर्श,. बैच विधि सीधे nucleation क्षेत्र में तेज़ (चित्रा 1B) की उचित राशि के साथ मिश्रण का प्रोटीन से प्रोटीन लाने पर निर्भर करता है है. आमतौर पर इस विधि / आयल खनिज तेल मिश्रण करने के लिए ड्रॉप से बाहर पानी के प्रसार को रोकने के तहत किया जाता है.
यहाँ हम वाष्प प्रसार के लिए प्रयोगात्मक स्थापना के दो प्रकार का प्रदर्शन, ड्रॉप और ड्रॉप बैठे बैच crystallization के तहत तेल के अलावा, फांसी जाएगा.
Protocol
सामग्री:
- प्रोटीन नमूना - Lysozyme (50 मिलीग्राम / एमएल)
- 24 अच्छी तरह से ड्रॉप ट्रे फांसी
- 24 अच्छी तरह से ट्रे ड्रॉप बैठे
- Microbatch crystallization 96 अच्छी तरह से ट्रे
- Crystallization समाधान (या तो उपलब्ध वाणिज्यिक या घर बनाया)
- सिलिकॉन तेल
- 5 Luer ताला बिना एमएल सिरिंज
- Siliconized कवर स्लाइड्स
- ऑप्टिकल सील टेप
- तेल
- कम प्रतिधारण सुझावों के साथ 0.1-2 μL micropipette
- चिमटी
- व्यावसायिक पोंछे
1. हैंगिंग / ड्रॉप प्रक्रिया बैठे:
- एक प्रारंभिक स्क्रीन के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीन है कि परीक्षण शर्तों के विरल मैट्रिक्स अधूरा भाज्य विधि शोषण का उपयोग कर सकते हैं. विरल मैट्रिक्स अधूरा भाज्य विधि द्वारा पक्षपाती है और बड़े अणुओं के लिए जाना जाता crystallization शर्तों (कार्टर और कार्टर, 1979; Cudney एट अल, 1994; Jancarik और किम, 1991;. Jancarik एट अल, 1991) से चयनित. यदि crystallization हालत पहले से ही जाना जाता है, एक संकीर्ण स्क्रीन, इकट्ठा किया जा सकता है तेज़ और मूल हिट आसपास एकाग्रता पीएच अलग. सबसे अधिक सफल तेज़ polyethylene (खूंटी) glycol, अमोनियम सल्फेट के बाद है. साथ में, सभी रिकॉर्ड macromolecular crystallization (Gilliland एट अल, 1994; Kimber एट अल, 2003;. पेज एट अल, 2003) के लिए इस्तेमाल किया precipitants के लगभग 60% के लिए इन दो precipitants खाते.
- अपने crystallization समाधान तैयार है. आमतौर पर इन शर्तों एक precipitating एजेंट, किसी तरह का नमक और एक बफर पीएच सेट से संयुक्त कर रहे हैं. कुछ मामलों में additives हित के प्रोटीन के लिए विशेष रूप से जोड़ा जा सकता है. सभी शेयर समाधान 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. शेयर समाधान के कुछ बहुत चिपचिपा हो सकता है (50% खूंटे, ग्लिसरॉल, खूंटी MME, आदि).
- एमएल 0.6 से 1.5, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 0.1 एम NaOAc पीएच 4.0, 4.3, 4.6 और 4.9 में 1.6 एम NaCl प्रत्येक (कुल 24 समाधान के) तैयार
- पहले गला लें, अपने प्रोटीन का नमूना और बर्फ पर रख. प्रोटीन शेयरों -80 ° सी में संग्रहित किया जाना चाहिए जब तक ब्याज की प्रोटीन / पिघलना चक्र फ्रीज करने के लिए संवेदनशील है (यदि हां, तो 4 बजे दुकान ° सी). विशिष्ट प्रोटीन सांद्रता 5-50 मिलीग्राम / एमएल की रेंज में उच्च सांद्रता आम तौर पर बेहतर परिणाम देने के साथ कर रहे हैं.
- स्पिन नमूना 15min/18 000xg / 4 डिग्री सेल्सियस कुछ प्रोटीन आंशिक रूप से समग्र और एक पिघलना कदम के बाद वेग के लिए करते हैं. इन समुच्चय प्रोटीन अणुओं के बाकी के अनाकार वर्षण को बढ़ावा देने इसलिए पूरी तरह से स्पिन नीचे यह सुनिश्चित करेंगे कि आप केवल अपने नमूने में घुलनशील अणु कर सकते हैं. ट्रे सेटिंग जब तक बर्फ पर प्रोटीन रखें.
- उसके absorbance से 280 एनएम पर एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. प्रोटीन एकाग्रता absorbance के पढ़ने और प्रोटीन विलुप्त होने के गुणांक से गणना की जा सकती है. : विलुप्त होने के गुणांक Expasy वेबसाइट पर ProtParam उपकरण के साथ गणना की जा सकता है http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- 24 अच्छी तरह से लटका / ड्रॉप ट्रे ट्रे सेटअप योजना (चित्रा 2B) के अनुसार तेज़ समाधान के 500 μL के साथ बैठे कुओं भरें. अच्छी तरह के किनारे चारों ओर एक सिलिकॉन तेल अंगूठी बनाएँ. अंगूठी के लिए एक छोटी सी के रूप में अच्छी तरह से सील है करने के लिए हवा के दबाव buildup को रोकने के अंतराल होना चाहिए. बैठे बूंदों में, वहाँ के तेल के बाद से अच्छी तरह से टेप के साथ बंद है (2A चित्रा) के लिए कोई ज़रूरत नहीं है.
- एक कवर स्लाइड ले लो और यह संघनित हवा स्प्रे, या एक पोंछ पेशेवर के साथ साफ - धूल से बचने के crystallization ड्रॉप की व्याख्या आसानी और contaminations को समाप्त होगा. बूँदें बैठे करने के लिए, स्लाइड कवर नहीं किया जाता है. इसके बजाय, अच्छी तरह से एक शेल्फ पर जो प्रोटीन और तेज़ मिश्रित कर रहे हैं शामिल हैं.
- बराबर मात्रा में प्रोटीन का नमूना और जलाशय समाधान के कवर स्लाइड पर रखो. अनुकूलन प्रक्रिया के हिस्से के रूप में अलग - अलग मात्रा में प्रोटीन और तेज़ की कोशिश की जा सकती है. संतुलन के बाद छोड़ देता है, जो पतला प्रोटीन के नमूने के लिए वांछनीय हो सकता है, और क्रिस्टल nucleation या विकास की धीमी गति कर सकते हैं में प्रोटीन का एक शुद्ध एकाग्रता में तेज़ परिणाम की तुलना में अधिक प्रोटीन का उपयोग. ड्रॉप समाधान में कोई अन्य nonvolatile पदार्थ भी एक ही कारक द्वारा केंद्रित किया जाएगा. जब कवर स्लाइड पर प्रोटीन और जलाशय समाधान pipetting, अत्यंत बुलबुला गठन से बचने के सावधान रहना. यह अक्सर तब होता है जब हवा विंदुक के बाहर उड़ा दिया है.
- हैंगिंग ड्रॉप: 0.02 एम NaOAc 4.9 पीएच में कवर स्लाइड के केंद्र के लिए 50 मिलीग्राम / एमएल lysozyme 2 μL लोड और इसे करने के लिए जलाशय समाधान के 2 μL जोड़ें.
- बैठे ड्रॉप: लोड 50 मिलीग्राम / एमएल lysozyme शेल्फ के केंद्र के समाधान के 2 μL और इसे करने के लिए जलाशय समाधान के 2 μL जोड़ें.
- कवर स्लाइड धीरे से पलटें और यह अच्छी तरह से शीर्ष पर तेल की अंगूठी पर नीचे रखना. नीचे धीरे इतना है कि अच्छी तरह से हवा से पायदान के माध्यम से बच सकते हैं तेल में जनसंपर्क प्रेसघटना में अच्छी तरह से हवा के दबाव buildup और रखना अच्छी तरह से सील किया गया. एयर अच्छी तरह से में दबाव buildup कवर स्लाइड बढ़ाने, अच्छी तरह से सील समझौता कर सकते हैं. बैठे ड्रॉप विधि में, ऑप्टिकली स्पष्ट पारदर्शी टेप करने के कुओं को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसलिए, इस विधि सील में हर पंक्ति / स्तंभ जगह ले जाएगा.
- अगले अच्छी तरह पर ले जाएँ जब तक ट्रे पूरा हो गया है.
- सेटअप पर ट्रे की जाँच करें - धूल कणों और अन्य contaminations को नष्ट करने प्रोटीन क्रिस्टल की झूठी सकारात्मक पहचान को कम कर सकते हैं.
- स्कोरिंग शीट का प्रयोग करें अपने प्रयोग दस्तावेज़.
- वांछित ऊष्मायन तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान के बीच आम तौर पर ट्रे, प्लेस. 20 ° C सबसे अधिक सफल है. ट्रे धीरे संभाल और किसी भी मिलाते से बचने के लिए ध्यान रखना. सावधान रहो, जबकि खोलने और इनक्यूबेटर दरवाजा बंद. कंपन या हस्तांतरण या ऊष्मायन के दौरान तापमान में परिवर्तन क्रिस्टल वृद्धि को रोकने या नकारात्मक क्रिस्टल गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. सामग्री (उदाहरण पैकिंग फोम) को अवशोषित सदमे क्रिस्टल ट्रे के तहत padding के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- क्रिस्टल के लिए ट्रे अगले दिन की जाँच करें, और फिर हर कुछ दिन, हमेशा देखभाल के साथ ट्रे से निपटने. एक ट्रे विशिष्ट स्कोरिंग पत्रक में किसी भी निष्कर्ष दस्तावेज़ ड्रॉप morphologies. कण आम तौर पर 2-5 दिनों लेने के लिए दिखाई देते हैं, हालांकि क्रिस्टल कभी कभी बहुत जल्दी (लगभग तुरंत) या बाद में (कई महीनों के लिए!) दिखाई देते हैं. एक बार crystallization शर्तों की पहचान की गई है और क्रिस्टल की वृद्धि दर में जाना जाता है, यह सबसे अच्छा है ट्रे undisturbed छोड़ जब तक क्रिस्टल दिखाई दिया और अपने अंतिम आकार के कम से कम आधा हो गई. ट्रे undisturbed छोड़कर क्रिस्टल nucleation घटनाओं की संख्या कम है, इसलिए बड़े क्रिस्टल के छोटे संख्या का निर्माण कर सकते हैं.
2. प्रक्रिया Microbatch:
- प्रोटीन नमूना और तेज़ तैयारी के रूप में ऊपर वर्णित हैं.
- एयर स्प्रे एक नया microbatch ट्रे धूल और अन्य बड़े कणों से बचने के लिए.
- Microbatch ट्रे में, 3 मिमी उच्च (बस कुओं को कवर पर्याप्त) पैराफिन तेल भरने. तेल के उपयोग निकालें.
- अच्छी तरह से पहले से भरे तेल में प्रोटीन समाधान (50 मिलीग्राम / एमएल lysozyme) की एक μL का लोड - अच्छी तरह से नीचे (2A चित्रा) के लिए समाधान सीधे विंदुक सुनिश्चित करें.
- यकीन है कि बूंद प्रोटीन छोटी बूंद के साथ अच्छी तरह से और फ़्यूज़ के नीचे डूब बनाते हैं - अच्छी तरह से ट्रे सेटअप (चित्रा 2B) योजना के अनुसार में शीघ्र समाधान के 1 μL लोड.
- अगले अच्छी तरह से ले जाएँ जब तक ट्रे पूरा हो गया है.
- 11-14 फांसी / ड्रॉप प्रक्रिया बैठे के चरणों का पालन.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
Crystallization आमतौर पर एक्स - रे क्रि की टोंटी के रूप में जाना जाता है. Precipitating शर्तों के एक विरल मैट्रिक्स अधूरा भाज्य स्क्रीन आमतौर पर प्रोटीन एकत्रीकरण और वर्षा के कई अलग अलग प्रकार उन्हें बड़े एकल क्रिस्टल के बीच पैदा करता है. यदि प्रोटीन या तेज़ सांद्रता भी उच्च रहे हैं एक कोई अलग आकृति और आकार (अनाकार वर्षण) के साथ भूरे रंग के मामले को देख सकते हैं. जब समाधान undersaturated है, ड्रॉप अक्सर पूरी तरह से स्पष्ट रूप से किसी भी तरह से रहित हो जाएगा. चित्रा 3 वर्षण घटनाएं और क्रिस्टल (Dessau एट अल., 2006) के लिए कई उदाहरण दिखाता है . अधिक विस्तृत व्याख्या के साथ तेज़ी घटना में पाया जा सकता http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .
चित्रा 1. प्रोटीन crystallization के सिद्धांत.
प्रोटीन crystallization के सिद्धांत. (ए) एक भाप प्रसार प्रयोग में तेज़ और प्रोटीन के बराबर मात्रा में ड्रॉप में मौजूद हैं. पानी के बाहर फैलाना और दोनों तेज़ और प्रोटीन एकाग्रता जब तक ड्रॉप और जलाशय समाधान के बीच संतुलन हासिल की है दोगुना हो जाएगा. (बी) बैच crystallization में तेज़ और प्रोटीन एकाग्रता प्रयोग के दौरान बदल नहीं है. एक प्वाइंट - प्रोटीन undersaturated रहता नहीं, क्रिस्टल, का गठन किया जा सकता है - प्वाइंट बी प्रोटीन nucleation होते हैं, क्रिस्टल के लिए फार्म शुरू कर दिया और समाधान में प्रोटीन की एकाग्रता संतृप्ति की बूँदें. प्वाइंट सी - प्रोटीन precipitates, लेकिन क्रिस्टल अभी भी लंबी हो सकती है. (सी) डायलिसिस का उपयोग कर एक crystallization केशिका जेल खामियों को दूर किया. कण दिखाई देते हैं के रूप में नमक प्रोटीन के नमूने के बाहर जेल प्लग भर में (और / या तेज़ diffuses प्रोटीन के नमूने में) diffuses.
चित्रा 2. विशिष्ट प्रोटीन crystallization प्रयोगों की बाह्यरेखा.
(ए) ड्रॉप वाष्प प्रसार फांसी ड्रॉप वाष्प प्रसार बैठे, और microbatch प्रोटीन crystallization के लिए प्रक्रिया. प्रत्येक मामले में, केंद्रित प्रोटीन के नमूने की एक छोटी मात्रा precipitan के एक बराबर या छोटी मात्रा के साथ मिलाया जाता हैटी समाधान और संतुलित अनुमति दी. (बी) चिकन lysozyme, 24 अच्छी तरह से एक ट्रे के crystallization के लिए सोडियम क्लोराइड के विभिन्न सांद्रता (तेज़) के साथ और विभिन्न PHS में बफर के रूप में 0.1 एम सोडियम एसीटेट (4.0 - 4.9) के साथ सेट कर दिया जाता है.
चित्रा 3. एक प्रोटीन crystallization प्रयोग की विशिष्ट परिणामों.
(ए) अनाकार वर्षण. जब प्रोटीन या तेज़ (या दोनों) उच्च एकाग्रता में हैं. (बी) चरण जुदाई. प्रोटीन या डिटर्जेंट एक अलग चरण के लिए अलग है जब उच्च एकाग्रता में कुछ precipitants के साथ मिश्रित हो सकता है. (सी) रॉड AtCSN7 के आकार का प्रोटीन क्रिस्टल polyethylene glycol 8000 में और मैग्नीशियम एसीटेट (Dessau एट अल., 2006) प्राप्त की . (डी) Lysozyme क्रिस्टल 1.0 एम NaCl और सोडियम एसीटेट पीएच 4.9 में प्राप्त की. (ई) संतृप्त बूंदों के तहत आमतौर पर स्पष्ट रहना. मोशे Dessau द्वारा फोटोग्राफ़ी.
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Discussion
हम इस लेख में वर्णन है और प्रोटीन crystallization के लिए सामान्य वर्तमान प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. यह एक बहु कदम प्रक्रिया के बाद से वहाँ कुछ विचार कर रहे हैं एक की जरूरत के बारे में पता हो. जब बहुत छोटी मात्रा (0.5-2 μL), वाष्पीकरण के कारण बूंद के सुखाने के साथ काम करने के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय है. इसलिए, यह एक अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में काम (कम वायु प्रवाह, उच्च आर्द्रता और तंग तापमान नियंत्रण के साथ) और एक तकनीक है कि खुली हवा के लिए ड्रॉप का जोखिम minimizes को अपनाने की सिफारिश की है. इस कारण से, यह अच्छी तरह का आयोजन एक काम वातावरण में संचालित करने के लिए आवश्यक है. सभी अभिकर्मकों पहले तैयार किया जाना चाहिए करने के लिए ट्रे और प्रयोगशाला के उपकरण की स्थापना आसान पहुंच के (pipetors, सुझावों, ट्यूबों, पोंछे, आदि) के भीतर होना चाहिए.
एक सामान्य नियम के रूप में, अपने प्रोटीन बाहर ले भंडारण के रूप में करीब के रूप में संभव समय आप स्थापित हो जाएगा ट्रे. इस तरह, वहाँ अपने नमूना पर कम पर्यावरणीय प्रभावों रहे हैं. ट्यूब की गर्दन और नहीं तल पर जहां प्रोटीन होता है, इसलिए नमूना अपने शरीर के तापमान से गर्म नहीं मिल जाएगा द्वारा प्रोटीन ट्यूब पकड़ यह बहुत महत्वपूर्ण है. उपरोक्त सावधानियों के साथ, त्रुटि की प्रयोगात्मक हाशिये, कम से कम किया जा सकता है इस प्रकार परिणामों के reproducibility बढ़ाने.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के लिए कई संभावित संशोधन कर रहे हैं. , पीएच और विभिन्न additives जोड़ा जा सकता है - एक प्रोटीन एकाग्रता, प्रोटीन / तेज़ अनुपात, तापमान (37 डिग्री सेल्सियस 4 ° सी) में परिवर्तन कर सकते हैं प्रोटीन crystallization के लिए एक और अपेक्षाकृत आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि डायलिसिस है. इस विधि में, प्रोटीन समाधान एक अर्द्ध पारगम्य झिल्ली के माध्यम से एक तेज़ समाधान के खिलाफ dialyzed है. डायलिसिस परीक्षणों और अधिक स्थापित करने के लिए बोझिल हैं, लेकिन डायलिसिस की एक और लाभ यह है कि कम ईओण शक्ति का precipitations शर्तों आसानी से परीक्षण किया जा सकता है. यह वांछनीय है अगर प्रोटीन खराब कम नमक सांद्रता में घुलनशील है, के बाद से तो प्रोटीन के रूप में नमक प्रोटीन बफर से दूर dialyzed है मणिभ सकता है. एक ठोस चरण (जेल) डायलिसिस की दर को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक केशिका के अंदर एक agarose जेल प्रोटीन और तेज़ समाधान (चित्रा 1C) के बीच प्रसार इंटरफ़ेस के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Supersaturation के ठीक नीचे एक बिंदु के लिए एक precipitating एजेंट की एकाग्रता बढ़ाने और फिर पीएच या तापमान को एडजस्ट करने के लिए प्रोटीन की विलेयता कम कम प्रोटीन एकाग्रता के साथ नमूने मणिभ बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीएच का संशोधन वाष्प प्रसार तकनीक, जब अस्थिर एसिड और एसिटिक एसिड, अमोनियम हाइड्रॉक्साइड या अमोनियम एसीटेट जैसे अड्डों (McPherson, 2004) का उपयोग किया जाता है के साथ बहुत अच्छी तरह से पूरा कर सकते हैं.
बैच सूक्ष्म तकनीक में तेल के मिश्रण की एक पूरी सरणी के लिए कुओं को कवर करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है. विभिन्न तेलों अलग वाष्पीकरण permeabilities है, और इसलिए तेल के तहत मिश्रण / प्रोटीन तेज़ की एकाग्रता में परिवर्तन के विभिन्न दरों का उत्पादन.
Crystallization पास परमाणु संकल्प पर अणुओं की संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए अपेक्षित कदम है. यहाँ वर्णित विधियों इसलिए कर रहे हैं एंजाइम तंत्र और प्रोटीन, प्रोटीन या प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए मौलिक है, और अंततः एक संरचना के आधार पर दवा डिजाइन और विकास में सबसे महत्वपूर्ण उपकरण के.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक Burroughs Wellcome अन्वेषक YM पुरस्कार और एक ब्राउन Coxe येल विश्वविद्यालय से Postdoctoral एमडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | |
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | |
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
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